牛活体采卵技术研究进展

姚顺，赵明礼，张明，杜卫华，戴蕴平，朱化彬

（1.广西大学亚热带农业资源保护与利用国家重点实验室，南宁 530004；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193；3.天津中科博雅生物育种研究有限公司，天津 300000；4.中国农业大学生物学院，北京 100193）

虽然胚胎移植技术在奶牛和肉牛生产中得到了广泛应用，但是超数排卵生产体内胚胎的效率近70年来几乎没有提高[1]。近年来，随着体外受精（Fertilization in vitro，IVF）技术的不断完善，体外受精胚胎成为牛胚胎移植的重要胚胎来源，特别是活体采卵（Ovum pick up, OPU）生产的体外受精胚胎。OPU技术可借助超声波仪器，通过穿刺从母牛活体卵巢上可见卵泡中采集卵母细胞用于牛体外胚胎生产（In vitro production，IVP），从而生产大量遗传背景清晰的体外受精胚胎，因此，牛活体采卵体外生产胚胎（OPU/IVP）技术经过不断改进和完善，极大地提高了良种母牛卵子的利用率和繁殖效率，成为快速扩繁优秀母牛的技术，在全世界，尤其是美洲国家得到广泛应用[2]。

本文主要综述牛OPU技术优势，重点分析影响OUP效率的因素，以期为牛OUP胚胎生产提供参考。

1 OPU 的技术特点和优势

OPU作为一项重要的繁殖技术，具有胚胎生产效率高、获得卵母细胞种源明确、可大幅提高良种母牛的利用效率和可控制胚胎性别等优势，相较于传统育种具有更高的选择强度和更短的世代间隔。该技术的应用推动了良种牛的基因修饰和早期胚胎的育种值评估。

1.1 胚胎生产效率高

采用人工授精，一头优质母牛每年仅能生产一头牛犊。利用超数排卵结合胚胎移植技术，与正常发情期相比可获得更多的胚胎，但生产胚胎数量仍十分有限，一头牛每年最多能生产20枚左右胚胎，年均产犊数（以受孕率50%计算），一头优质母牛每年最多只能生产10头牛犊，且每次只能与一头公牛进行受精，并需要外源激素处理，对母牛后续的生殖功能可能造成影响。活体采卵技术每头供体牛每次可获得10～50枚卵母细胞，每年最多可生产50头小牛，数量多且稳定，可大大提高繁殖效率，是现有繁殖技术中效率最高的[3]。

1.2 卵母细胞遗传背景清晰

进行活体采卵的供体母牛往往拥有详细的系谱资料，因此，利用活体采卵技术获得的卵母细胞系谱齐全、遗传背景清晰。可在综合考虑生产性能、体型外貌和遗传缺陷检测的基础上对受精的精液进行选择，提高选配的科学性。

1.3 可充分利用优秀的母牛及推动品种保护

OPU/IVP可用于3月龄以上的犊牛及孕早期（怀孕3个月以内）、围产期、超数排卵效果不明显和输卵管堵塞的母牛[3]，从而可充分利用优秀的母牛，极大地提高良种母畜的利用效率，对品种保护和改良均具有积极意义。例如，印度由于宗教原因不允许宰杀牛，通过对印度地方品种Karan Fries牛进行OPU收集卵母细胞，进行胚胎移植，有力地保护了地方优良品种[4]。

2 影响OPU 效率的因素

目前，OPU技术已成为体外生产优质牛胚胎的有效途径，但其效率受诸多因素影响，供体牛年龄、OPU频率、外源激素处理、优势卵泡的去除与否和动物发情周期等均会影响OPU的效率[5]。

2.1 供体牛年龄的影响

母牛性成熟一般在8～12月龄，适宜的初配年龄在16～27月龄，对幼畜进行OPU能缩短世代间隔一年以上。但由于幼畜进行OPU时，尚未获得表观信息，选择的准确性不高，可以抵消了这一优势，且对幼牛进行OPU需采取侵入性更强的手术法，涉及动物福利问题，此外与成年牛来源的卵母细胞相比，幼牛的卵母细胞发育率明显较低，所以目前不常对幼牛进行OPU[3]。

2.2 采卵频率的影响

OPU频率通常为一周一次、一周两次或两周一次。其中，一周一次与两周一次的效果类似；一周两次的OPU效果更优。一周两次的时间间隔为2～3d[6]，3d后牛卵巢可再次形成优势卵泡；此时如不及时采卵，改为间隔7d的每周一次采取，由于优势卵泡主控了促卵泡素（follicle-stimulating hormone, FSH）的合成分泌，可导致劣势卵泡的衰退和闭锁，从而使卵母细胞数量减少；每周采卵两次能有效避免优势卵泡对从属卵泡的影响。无外源激素处理下，一周进行两次OPU的供体牛，无性周期、无黄体、无高水平雌激素[3]，而高水平雌二醇会对卵母细胞成熟和发育能力产生不利影响[6]。每周三次OPU，不符合动物福利、成本高，且频繁的穿刺会对卵巢造成损伤，影响牛的内分泌[3]。

2.3 激素处理的影响

为了提高OPU的效果，采卵前常使用FSH或孕马血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotrophin, PMSG）处理供体母牛。1978年，Brown提出了FSH阈值理论，认为FSH浓度在卵泡发育早期相当重要，一旦FSH达阈值，卵泡即迅速进入生长阶段；FSH超过阈值的程度及其持续时间最终决定成熟卵泡的数目[7]。研究人员采用切除垂体、切断下丘脑和用GnRH拮抗剂处理等方法抑制或阻断促性腺激素的分泌，造成全部有腔卵泡停止生长，证明了FSH可促进卵母细胞发育[8]。此外，人为提高FSH浓度可使更多的卵泡参与周期性募集[9]。幼牛的OPU需要与外源激素配合以提高获得的卵母细胞质量[10]。多数研究表明，外源激素对成年牛和妊娠母牛的OPU效果有显著的促进作用[11]，可提高供体奶牛卵裂率和囊胚率，原因是FSH利于卵泡发育同期化，使卵泡发育整齐，有利于卵母细胞发育和在采卵前卵母细胞在体内的成熟[12]。但有一部分研究显示，外源激素预处理对OPU效果无显著影响，原因可能是随着激素的持续使用，卵巢上激素受体的敏感性下降所致[13]。

FSH预处理效果优于PMSG预处理[13]，当FSH和PMSC分别处理营养不良且长期不发情的荷斯坦牛时，FSH预处理组的可穿刺卵泡数和获得卵母细胞数均多于PMSC预处理组[14]。但陈明棠等在富钟水牛研究PMSG和FSH预处理对OPU效果的影响时，发现PMSG组与FSH组的可用率、平均每头可用卵母细胞数无显著差异[15]，这可能是由于品种间的差异造成的。当每周采卵两次时，激素预处理对OPU的效果无显著影响，可能是每周两次的采卵使内源性FSH浓度升高，从而掩盖了外源FSH的作用[16]。用30%的聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone, PVP）溶解FSH可延长FSH在牛体内的半衰期，显著提高活体采卵的效果[17]。因此，需根据供体牛的年龄和状态，选择合适的激素种类和注射剂量[5]，同时兼顾生产成本和收益。

2.4 优势卵泡的影响

牛的每个发情周期有2～3批原始卵泡发育为三级卵泡，即有2～3个卵泡波。有研究表明，1组直径约为3mm的有腔卵泡，在FSH作用下生长形成1个卵泡波，2～3d后形成1个优势卵泡，直径达8～10mm，开始抑制从属卵泡的生长发育。其抑制途径有两个，一是优势卵泡可分泌抑制素（主要是抑制素B），反馈抑制垂体前叶分泌FSH；二是发育中的优势卵泡快速生长，随着卵泡的生长和颗粒细胞的增多，血清中雌激素水平升高，从而降低FSH浓度[9]。而优势卵泡因具有大量的FSH受体，可补偿低FSH水平，并继续发育。

鉴于优势卵泡对从属卵泡的抑制作用，去除优势卵泡（DFR）与否成为影响OPU效率的重要因素。研究发现，去除优势卵泡后1.5d，内源性FSH浓度激增，2d后发生新的卵泡波[18]。去优势卵泡前原有的和之后新产生的卵泡波中的中、小卵泡是卵母细胞的主要来源。卵母细胞在卵泡中生长时间越长，其中储存mRNA和蛋白质越多，其拥有更强的胚胎发育能力[19]。

在DFR-OPU 1/W、DFR-FSH-OPU 1/W和FSHOPU 2/W组合中，效果最好的是DFR-FSH-OPU 1/w组合。在DFR-FSH-OPU 1/w中，内源性FSH升高与注射的FSH相叠加，使FSH峰升高且延长了持续时间，从而产生了更强的卵泡波反应， FSH注射与进行OPU之间的48h滑行阶段（FSH饥饿阶段）为卵母细胞发育的最佳时机[20]，加上之前DFR的促进作用，使该组合产生的囊胚总量最多。超数排卵中，长期外源激素刺激会使卵泡处于加速生长阶段，使卵泡中的卵母细胞未获得充分的发育能力[20]。48h的FSH饥饿使卵泡生长停滞，让卵母细胞质“赶上”卵泡成熟和呈现早期闭锁样状态[21]。对牛而言，早期闭锁似乎与体内的排卵前成熟状态类似，因此，增强了卵母细胞发育能力[22]。

2.5 供体牛发情周期的影响

一般处于乏情期的母牛卵泡数较少，卵巢质地偏硬，不适于进行活体采卵[23]。发情期的不同阶段活体采卵效果也有明显差异。Pieterse等研究显示发情周期的第3～4天可吸取卵泡数多于第9～10天和第15～16天[24]。朱化彬等研究发现，发情当天获得的卵母细胞数和可用卵母细胞数均少于发情第7天和第7～15天，这是因为发情当天吸取了卵巢上大卵泡形成的凹陷及卵泡膜阻碍了周围其他小卵泡的采集[25]。

2.6 其他因素

除了以上因素，OPU效率还会受到个体差异[26,27]、健康状况[8]、季节[23]、品种[28]、真空泵压力[5]等多方面的影响。

Pontes等对317头内洛尔牛（Nelore）进行跟踪研究，发现不同个体的OPU效果存在明显差异，但同一供体在不同时期的OPU效果相似[26]。卵母细胞质量好（即体外受精后囊胚质量高）的供体卵母细胞内的谷胱甘肽(glutathione GSH)浓度显著高于质量差的卵母细胞的浓度，氧化应激标志物谷胱甘肽过氧化物酶在较差供体来源的卵丘-卵母细胞复合物（COCs）中的含量显著高于较好供体来源的COCs，谷胱甘肽合成酶在较好供体来源的COCs中的含量显著高于来自较差供体来源的COCs，可见提高卵母细胞中谷胱甘肽浓度可以减少供体间胚胎生产的差异[19]。

前人研究表明，牛的卵泡形成、卵母细胞质量和受精率受环境温度影响，而环境温度可能影响类固醇激素水平，并延迟卵母细胞的细胞膜内黄体溶解和脂肪酸组成。Zou等发现夏季每个卵巢少于10个卵泡的卵巢的百分比明显高于冬季，此外，卵泡液、颗粒细胞和卵母细胞中脂肪酸组成在两个季节有明显的差别[29]。Wilson认为母牛在热应激情况下，由于黄体溶解延迟和雌二醇水平降低，卵泡的形成会受到延迟[30]，因此夏季的OPU效果明显降低。

Nelore牛的卵泡数多于B.taurus牛[28]。目前，Nelore母牛比B.Taurus母牛产生更多卵泡的原因仍未清楚。在雌性Nelore和B.Taurus的胎牛或者小牛中窦前（原始、初级和次级）卵泡数量并没有显著差异，表明总卵泡数量不是卵母细胞产量差异的原因[28]。可能是在Nelore牛中的卵泡闭锁速率较低。另一个值得考虑的原因是卵泡的更新，该问题有待进一步的研究[31]。

3 OPU/IVP 所得后代性别比例

2016年通过OPU共收集约200万枚卵母细胞，获得可移植胚胎65.6万枚，其中约30万枚胚胎是由性控精液受精产生[2]。

1991年研究报道了第一例IVF牛的性别偏差[32]。不同的研究中OPU/IVP产生的后代性别比例结果不尽相同，OPU/IVP是否对后代性别比例造成影响目前无统一的定论。Machado等表明用Pecoll离心处理后的精子通过IVP后获得胚胎雌性和雄性比例无显著差异[27]。巴西In vitro Brasil有限公司在大量OPU/IVP重复实验中统计的雌雄性别比例也均为1：1[5]。然而，有研究表明一种巴西Gyr奶牛通过OPU采卵后进行IVP与人工授精和自然交配相比，获得的后代雄性比例高达76.9%，显著高于雌性[33]。造成OPU/IVP生产中性别比例偏离自然状态的部分原因是精子制备液和培养液[33]。配子发生和早期胚胎发育过程中基因组有两次甲基化和去甲基化，大多数母源印记发生在第二次减数分裂中期，父源印记基因在IVF前已完成重编程。卵母细胞体外培养，超数排卵和IVF可能干扰卵子的甲基化。该过程中辅助生殖可能引起表观遗传变异，体外培养可以干扰X染色体失活的表观遗传过程[34]。X染色体失活是雌性胚胎在早期发育中经历的表观修饰事件，如果这一机制被削弱，会导致雌性胚胎发育异常，进而导致性别失衡，而通过改变体外受精培养方法，可以矫正性别比例偏差[35]。

4 结束语

OPU是获取高价值的、珍稀品种的牛卵子的重要手段，其通过结合最优秀的公牛和母牛加速遗传增益，在推动良种牛繁育、优化牛群结构、保护优良种质资源和推动畜牧业发展中扮演着重要角色。研究者不断优化OPU方案，以期获得更多更优质的卵子，降低优质胚胎的生产成本。今后，仍需进一步推广OPU结合精子性控技术选择胚胎性别及OPU与胚胎冷冻保存的共同应用，以降低活体动物运输的成本和解除活体动物运输的限制，以最大限度地利用高遗传价值的供体牛。