基于透明标本研究巴西红耳龟幼体骨骼系统

黄鸣翔，郭 婷，荆 洵，黄诚彧，周 玲，刘 敏

(华中农业大学动物医学院，湖北 武汉 430070)

巴西红耳龟(Red-eared slider，Trachemysscriptaelegans)，在动物界属龟鳖目泽龟科滑龟属，是水栖龟，头侧中部的鼓膜上有桔红色或暗红色的椭圆形斑[1]。透明标本是用化学和物理的方法，使软组织的折光率和透明剂的折光率相近，从而使软组织透明，骨组织清晰显现[2]。巴西红耳龟幼体骨块比较小，骨与骨之间的软骨成分比较多，不易于做成骨骼标本，且尚未发现通过制作龟透明标本来研究骨骼系统的报道。故本试验拟采用透明标本制作技术来研究巴西红耳龟幼体的整体骨骼形态结构以及各骨块之间的位置关系，既可建立巴西红耳龟透明标本的制作方法，又可确定其骨骼系统的解剖学特征。

1 材料与方法

1.1 试验材料 幼龄期的巴西红耳龟。

1.2 试剂及工具 1%氢氧化钾(KOH)、茜素红溶液、3%过氧化氢(H2O2)、梯度(25%、50%、75%和100%)丙三醇、解剖刀柄、刀片、眼科镊子、量筒、容量瓶及广口瓶等。

1.3 制作方法

1.3.1 处理材料 将龟放入充满乙醚的容器中，使其吸入过量乙醚致死。用解剖刀在龟的后肢皮肤上切一个5～8 mm的口子，用镊子将内脏全部取出。

1.3.2 固定 将标本放入95%的乙醇中固定7 d，用玻璃板压住，使其完全浸没，隔2～3 d换液。

1.3.3 脱脂 将固定后的标本移入丙酮中，脱脂3 d。

1.3.4 透明 使用1% KOH将标本浸泡3～5 d，至肌肉及龟壳呈半透明状，并将龟壳上的角质盾片剥落。

1.3.5 染色 移至饱和茜素红溶液中，骨骼被染为紫红色为止，约3～5 d。

1.3.6 脱浮色 移至3% H2O2中脱浮色，能清晰看到骨组织紫红色为止，一般需要2～3 d。

1.3.7 梯度透明 依次移入25%、50%及75%的丙三醇中各浸泡3 d，至无多余的颜色浮出、骨组织清晰可见为止。

1.3.8 保存 移入100%的丙三醇中进行保存。

2 结果

2.1 染色结果分析 本试验制作的巴西红耳龟透明标本，形态完整染色均匀，可观察到巴西红耳龟的头部、四肢、龟壳、尾部、身体中部被茜素红染成了红色，说明这些部分含有能够与茜素红特异性结合的钙成分，为硬骨组织，其余的部分则透明无浮色，为软骨组织、肌组织和其他结缔组织。见中插彩版图1、2。

2.2 骨骼系统观察 本试验通过制作透明骨骼标本，发现巴西红耳龟骨骼可分为头骨、脊柱、肋骨和附肢骨。同时，龟鳖目是爬行纲中最为特化的一类，背腹具壳，是一种被动的保护性适应[6]。

2.2.1 头骨 面区短而窄，眼后则显著扩大，整个头骨较宽而扁平(见中插彩版图1A)。

2.2.2 脊柱 包括颈椎、躯椎、荐椎和尾椎。颈椎未与龟壳愈合，但由于龟壳的遮挡，颈椎无法清楚的观察到。躯椎与背部的髓板愈合，髓板是骨质的结构，会被茜素红染上颜色，覆盖在躯椎上。荐椎远端的膨大与腰带相连。尾椎有20枚左右，从前往后逐渐变小。

2.2.3 肋骨 龟类的肋骨数比较少，其中有8对紧密愈合于背壳的肋板。见中插彩版图1A，可以清晰看到与肋板愈合的8块肋骨和荐尾椎相连的比较小的肋骨，且中间的肋骨较长，两边的肋骨较短。

2.2.4 附肢骨 (1)前肢骨：分为肱骨、桡骨、尺骨、腕骨、掌骨和指骨(见中插彩版图1B)。①肱骨粗壮，弯成弓形，中段稍圆，两端微隆。②桡骨与尺骨并列，远端比近端略宽。尺骨较桡骨略微粗壮，近端比远端略宽(见中插彩版图1B)。③腕骨为不规则颗粒状，互相嵌合(见中插彩版图1B)。④掌骨有5枚，圆片状，前凹形。⑤指数13枚，各排指骨数为2、3、3、3、2(见中插彩版图1B)。(2)后肢骨：分为股骨、胫骨、腓骨、跗骨、跖骨、趾骨(见中插彩版图2B)。①股骨略弯，中段细圆，两端扩大。②胫骨与腓骨并列，腓骨比胫骨细弱，中间靠合形成长条形的间隙，远端与跗骨相接(见中插彩版图2B)。③跗骨中包括距骨和跟骨，胫骨一侧为距骨，腓骨一侧为跟骨，较小。④跖骨5根，粗细长短不一，第1根较粗，第4、5根较短(见中插彩版图2B)。⑤趾骨13枚，各排的数目为2、3、3、3、2(见中插彩版图2B)。

2.2.5 龟壳 龟壳由背部和腹部组成：背壳和腹壳。(1)背壳：向外凸的椭圆形。从中插彩版图1 A和1C中可清晰发现背壳有3列骨板：①围在边缘的11对缘板；②由前至后顺背中线排列的，近方形的一列髓板，大部分与下面的脊椎愈合。髓板的最前面一块称为颈板，最后一块又称为臀板或者后髓板；③位于缘板和髓板之间，长方形的8对肋板，排列为左右两列并与下面肋骨紧密联合。(2)腹壳：平板状，腹壳骨板是由成对的上腹板、舌腹板、下腹板、剑腹板以及前中位的单块内腹板构成(见中插彩版图2A、2C)。

3 小结

3.1 本试验通过与四爪陆龟[4]、幼发拉底河软壳龟[5]的骨骼系统相比较，通过透明标本的制作和观察验证了巴西红耳龟的骨骼系统与其他龟类大体相同。均可见头骨、脊柱、肋骨、附肢骨和龟壳。龟壳可分为背壳和腹壳，背壳中包含轴向骨骼元素：躯椎和肋骨[7]。脊柱包括颈椎、躯椎、荐椎和尾椎。附肢骨包括肩带、前肢骨、腰带、后肢骨等[4]。巴西红耳龟的部分骨骼数目与其他龟类仍有一些差异。其掌骨和跖骨均为5枚，指(趾)骨均为13枚。幼发拉底河软壳龟掌骨和跖骨为5枚，指骨17枚，趾骨15枚[5]。四爪陆龟的掌骨和跖骨为4枚，指骨6枚，趾骨8枚[4]，各指(趾)的节数略有差异。

3.2 在以往文献中未发现龟类透明标本制作的相关信息，根据刘万胜等[9]研究结果进行改进，设计了一套较合理的制作巴西龟幼体透明标本的方法。(1)用梯度乙醇(75%，85%，95%)脱水要比直接用95%的乙醇脱水效果好，能降低剧烈脱水对龟身体造成的伤害。(2)脱脂要充分，否则会影响后面步骤透明的效果。(3)透明的时间需视情况而定。过长会使骨骼松散，过短则影响染色效果。在透明的过程中，龟壳外层的角质盾片会被软化脱落。(4)巴西红耳龟较难染上色，所需时间稍长，一般是3～5 d。不要将茜素红配置成过饱和，会使标本染色过深，导致后续步骤脱浮色困难。(5)不同于雏鸡、青蛙等透明标本制作[8-9]采用的脱浮色试剂(梯度酒精和梯度丙三醇)，我们发现H2O2脱浮色效果更好，周期更短。缺点是会产生气泡，可以用注射器抽取消除。

3.3 本试验制作的标本头骨染色不太清晰，难以具体辨认头骨各部位。可能是在半透明、染色和脱浮色这一系列过程中，标本未用重物固定好，导致标本头部漂起，未完全没入液面，未经历这些步骤或经历时间不够。另外，有些骨位于龟壳内，部分结构被龟壳或肌肉遮挡，难以观察其完整结构和确定其数目。如标本肩带(肩胛骨、乌喙骨)、腰带(髂骨、坐骨、耻骨)、颈椎、躯椎、尾椎等。

龟作为一种较难以普通解剖方法进行骨骼研究的生物，尤其幼体骨骼发育不充分且个体较小[10]。透明标本这一种标本制作方法为研究动物龟幼体骨骼系统提供了实践基础，为胚胎学、解剖学提供了直观而清晰的形态学素材。其应用方面较为广泛，值得在研究中不断进行尝试改进。