液相色谱-串联质谱法测定果蔬中喹啉铜的残留量

徐 娟*， 李敏青， 邵琳智， 孙灵慧， 庄 嘉

(广州海关技术中心，广东广州 510623)

喹啉铜是一种有机铜螯合物杀菌剂，其杀菌作用主要取决于释放出的Cu2+浓度，但喹啉铜使用不当会污染环境，并在生物体内富集，进而危及人体健康。目前，我国国家标准《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》[1]和香港特别行政区《食物中除害剂残余管理规例》[2]中都规定喹啉铜的最大残留限量，涉及番茄、苹果、黄瓜、梨和日本柿子。

早期对于喹啉铜检测技术的报道主要集中在以下两类：一是采用不同方式测定喹啉铜中的铜，再转换计算喹啉铜的含量[3],或者利用铜离子氧化发光氨，通过分光光度计测定光吸收进而测出喹啉铜的含量[4]。这种思路的测定方法存在的主要问题是容易受到环境中铜本底的影响，前处理的仪器复杂，不利于方法的推广。第二种是采用各种破络剂，使喹啉铜解离或衍生后，测定其转化产物，这些方式测定存在的主要问题是前处理技术要求高，使用有毒有害的衍生试剂[5 - 6]。近年来国内已有采用反相高效液相色谱来测定喹啉铜的文献报道，其主要原理是在流动相中加入缓冲盐类或者使用十二烷基硫酸钠、三氟乙酸等离子对试剂，通过延长喹啉铜的保留时间，达到分离测定的目的。另外在前处理中，通常需要先使用较大体积的乙腈混合强酸/强碱超声提取后盐析，再用正己烷或者石油醚反萃，操作复杂且由于其选择性低，导致检出限难以满足要求[7 - 9]。

综合文献调研，未发现有应用液相色谱-串联质谱法对蔬菜和水果中喹啉铜残留量进行测定的相关报道，故本研究采用简单的液-液萃取(LLE)技术作为前处理手段，结合液相色谱-串联质谱联用技术，建立了蔬菜和水果中喹啉铜残留量的检测方法。本方法稳定、简便、灵敏，覆盖所涉及到的食品基质并满足最大残留限量的检测要求。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

TSQ Quantiva串联三重四极杆质谱仪，Ultimate 3000液相色谱仪(美国，Thermo Fisher公司)；Mill-Q去离子水发生器(美国，Millipore公司)；Sigma-3-18K离心机、Sigma-1-14离心机(德国，Sigma公司)；MS3 Basic涡旋混合器、T25匀浆刀(德国，IKA公司)；超声清洗仪(SONO Swiss公司)。

喹啉铜标准物质购自Dr.Ehrenstorfer公司(0.25克/瓶，纯度≥99.0%)；乙腈、乙酸(色谱纯，美国TEDIA Company)；无水MgSO4、PSA和C18粉(分析纯，美国Sigma-Aldrich，Missouri)；乙酸铵(质谱级，德国Fluka Chemie AG,Buchs)。实验所有用水均为Mill-Q超纯水。

苹果、梨、黄瓜和柿子均购自当地超市。

1.2 标准溶液的配制

准确称取喹啉铜标准品10 mg(精确到0.1 mg)于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成浓度为0.1 mg/mL的标准储备液，于-18 ℃以下避光保存，有效期6个月。准确吸取喹啉铜标准储备液1 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，此标准溶液为1 μg/mL，现用现配。

1.3 样品处理

称取5 g试样(精确至0.01 g)于50 mL具塞离心管中，加入10 mL 1%乙酸，超声15 min，4 000 r/min离心5 min，提取液收集于25 mL塑料容量瓶中；重复上述操作，合并上清液并以1%乙酸定容至25 mL。移取1 mL，加入装有50 mg PSA和50 mg C18粉末的高速离心管里，涡旋1 min后，以12 000 r/min离心5 min，取0.5 mL净化后的提取液，加入0.25%甲酸定容到1 mL后混合均匀，经0.22 μm微孔膜过滤后供LC-MS/MS分析。

1.4 色谱和质谱条件

色谱柱：GL Inertsil ODS-4柱(150 mm×2.1 mm，3 μm)；流动相：采用乙腈(A)和0.25%甲酸水(B)组成的流动相进行梯度洗脱，洗脱条件：0～5 min，A 由5.0%～30.0%;5.01 min，A由30.0%～5.0%;5.01～10.0 min A保持5.0%;10.0 min停止。流速:0.2 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：5 μL。

离子源:电喷雾离子源(ESI),温度350 ℃，电喷雾电压3 500 V；传输管温度：300 ℃；扫描方式:正离子模式;检测方式:多反应监测(MRM);鞘气(Sheath Gas):6 L/min；辅助气(Aux Gas):8 L/min；吹扫气(Sweep Gas):1 L/min；定性与定量离子对、去簇电压(RF)、碰撞能量(CE)等参数见表1。

表1 喹啉铜质谱条件参数

*Quantitative ion pair.

2 结果与讨论

2.1 喹啉铜与8-羟基喹啉的相关色谱研究

喹啉铜是有机铜螯合物，其在酸性条件下不稳定，很容易解离出Cu2+，从而转化为8-羟基喹啉，在传统的碘量滴定法中就是利用这一原理进行测定。本文基于这个原理，通过测定8-羟基喹啉从而实现测定喹啉铜的残留量。为了进一步确定喹啉铜和8-羟基喹啉的关系，实验分别对15 mg/L 8-羟基喹啉和喹啉铜溶液进行紫外-可见光谱扫描，结果分别见图1和图2。从光谱图中可以清楚看出，二者具有一致的最大吸收波长。根据喹啉铜和8-羟基喹啉的分子量和结构式，理论上1 mg/kg的喹啉铜完全转化为8-羟基喹啉应为0.825 mg/kg。为了确定喹啉铜的转化率，用1%乙酸溶液配制相同质量浓度的15 mg/L喹啉铜和8-羟基喹啉铜溶液，以液相色谱仪测定，以8-羟基喹啉计算喹啉铜，结果为13 mg/L，转化率为105%。同时，二者一致的保留时间也再一次证实在本方法条件下，可以认为喹啉铜全部转化为8-羟基喹啉(图3)。

虽然喹啉铜在测定的过程中转化为8-羟基喹啉，但是世界主要国家和地区的规定中所确定的残留定义物为喹啉铜，而本实验配制的标准溶液使用喹啉铜标准品配制，其质量浓度可以喹啉铜为计算标准。因此，按照本文方法依然把最后得到的色谱峰认为是喹啉铜的色谱峰，这样就不需要采用8-羟基喹啉来进行定量，然后再转换为喹啉铜，以利于标准的方便使用。同时，喹啉铜的有效成分是通过其释放出的Cu2+实现的，8-羟基喹啉无法替代喹啉铜达到防治病虫害的作用，同时后续方法验证实验时在空白实验中均未发现8-羟基喹啉残留。

图1 8-羟基喹啉的紫外-可见(UV-Vis)光谱图Fig.1 UV-Vis spectrum of 8-hydroxyquinoline

图2 喹啉铜的紫外-可见(UV-Vis)光谱图Fig.2 UV-Vis spectrum of oxine copper

2.2 检测条件的优化

图3 喹啉铜(峰1)和8-羟基喹啉(峰2)的色谱图Fig.3 Chromatograms for oxine copper(peak 1) and 8-hydroxyquinoline(peak 2)

2.2.1 色谱条件的优化喹啉铜是一种极性很强的化合物，根据文献报道[7 - 9]，在选用反相液相色谱进行测定时，采用C18色谱柱,而且均需要加入缓冲盐类(磷酸盐体系或乙酸钠-乙酸缓冲体系)来调节溶液至体系呈现酸性(pH=2.8～3.0)，或者在流动相中加入十二烷基硫酸钠、三氟乙酸等离子对试剂。因此，本实验首先使用文献报道中使用的普通Aglinet Eclipse C18色谱柱，试验了乙腈+水，甲醇+水，乙腈+5 mmol/L甲酸铵，甲醇+5 mmol/L甲酸铵，0.1%甲酸乙腈+0.1%甲酸，乙腈+20 mmol/L七氟丁酸共6种流动相体系。结果发现，缓冲盐和离子对试剂的加入，在使用串联质谱仪器作为检测器时，对化合物的响应有明显抑制，而0.25%的甲酸则对于峰形和响应值有改善，故选择0.25%甲酸+乙腈流动相体系。实验分别尝试了C18色谱柱、T3色谱柱、Hilic色谱柱等，最终确定GL Inertsil ODS-4色谱柱(150 mm×2.1 mm，3 μm)，采用乙腈-0.25%甲酸水溶液作为流动体系，流速为0.2 mL/min。该条件下目标峰的保留时间为6 min左右。

2.2.2 质谱条件的优化实验在ESI+模式下，采用蠕动泵连续进样，对喹啉铜进行母离子全扫描。结果表明，当以0.25%甲酸配制喹啉铜标准溶液(1 mg/L)，进行母离子扫描时，质谱图上可以看到喹啉铜的母离子峰m/z=351.95和8-羟基喹啉的母离子峰m/z=146.05(图4)；而以甲醇配制喹啉铜标准溶液(1 mg/L)，进行母离子扫描时，质谱图上也可以看到喹啉铜的母离子峰m/z=351.95和8-羟基喹啉的母离子峰m/z=146.03(图5)。这充分证明喹啉铜发生了源内裂解，而且，m/z=146.0是优势离子，这与文献报道[10]相一致。鉴于上述液相色谱部分已经确定喹啉铜在酸性条件下彻底转化成8-羟基喹啉，同时质谱碎片也证实，喹啉铜会裂解产生8-羟基喹啉的母离子峰为优势离子，故选定m/z=146.0作为母离子测定。

图4 喹啉铜标准溶液质谱图(1 mg/L，0.25%甲酸)Fig.4 Mass spectra of oxine copper standard solution(1 mg/L,0.25% formic acid)

图5 喹啉铜标准溶液质谱图(1 mg/L，甲醇)Fig.5 Mass spectra of oxine copper standard solution(1 mg/L,methanol)

对于不同的仪器确实可能存在不同的优势碎片，即使是同一仪器，采用Thermo TSQ Quantiva优化采集多次调谐时也会出现不同的优势离子，其中m/z=118为始终稳定出现的离子碎片，为了得到稳定可靠的离子对信息，本实验同时将得到的离子对信息在实际样品中进行对比，最后确定质谱参数见表1。

2.3 样品前处理优化

2.3.1 破络剂的选择参照国内发明专利中采用Na2S作为破络剂测定喹啉铜[11]，按照专利方法进行了操作，但实验结果显示对于目标色谱峰存在干扰峰且噪音背景高。根据文献报道，由于喹啉铜直接在酸性条件下就容易释放出Cu2+，以日本药典(JP XI)和我国台湾规定为例，对于喹啉铜作为一种农药的有效成分检测其含量时，主要是将喹啉铜通过酸性条件下转变成8-羟基喹啉，使用气相色谱仪或者紫外分光光度计测定，再通过摩尔系数转化计算产品中喹啉铜的实际含量[12 - 13]。因此后续优化实验设计采用不同的酸性溶液直接提取。

2.3.2 提取溶剂的选择喹啉铜不易溶解于水和有机溶剂，微溶于喹啉、吡啶、冰乙酸、氯仿和弱酸，溶于强酸，遇碱分解，根据这个特点并且结合文献，选取1%乙酸、0.1%甲酸、甲醇和乙腈，考察其提取效率。称取5 g空白试样(精确至0.01 g)于50 mL具塞离心管中，加入0.1 mL浓度为50 mg/L 喹啉铜的标准溶液，分别加入1%乙酸、0.1%甲酸、甲醇和乙腈各10 mL，超声15 min后，以4 000 r/min离心5 min，取上清液倒入25 mL塑料容量瓶中，再加入10 mL上述提取液，再次超声提取15 min后，以4 000 r/min离心5 min，合并上清液并以提取液定容至25 mL，取0.5 mL提取液，加入0.25%甲酸定容至1 mL，经0.22 μm微孔膜过滤后供LC-MS/MS分析。以化合物的响应值和谱图的背景干扰为筛选条件(图略)，结果表明提取效率最好的是1%乙酸，故提取溶剂选择1%乙酸。

2.3.3 提取时间的选择实验分别设置超声时间为15 min和30 min，考察提取时间对提取效率的影响，发现超声时间为15 min的效果最好，因此最终确定以1%乙酸提取后超声15 min。

2.3.4 净化方式的选择对于得到的提取液，考虑了三种净化方法：①150 mg Na2SO4+50 mg PSA，②50 mg PSA+50 mg C18，③无净化。取1 mL上清提取液分别加入装有上述净化粉末的高速离心管中，涡旋后采用12 000 r/min离心10 min，取0.5 mL净化液用0.25%甲酸定容至1 mL，混匀后经0.22 μm微孔膜过滤后供LC-MS/MS分析。上机测定结果显示化合物的响应结果几乎无差异，背景干扰同样未显示存在显著区别。考虑到本方法主要适用的基质为水果和蔬菜，实验采用50 mg PSA+50 mg C18这种净化组合方式。

2.4 线性范围、相关系数和基质效应评价

配制浓度为0、0.01、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/L的喹啉铜标准系列溶液，在确定的实验条件下进样，测定其峰面积，以浓度x(mg/L)为横坐标，峰面积y为纵坐标，绘制标准曲线。在选定的质量浓度范围内，喹啉铜质量浓度与峰面积呈良好的线性关系,线性方程为：y=2.36×104x-5.19×104(R2>0.99)。

实验考察了基质效应对于目标物响应值的影响，发现不同基质对于响应存在不同程度的抑制，但差异并不显著。同时根据仪器特性，在空白基质中添加水平0.1 mg/kg进行定量限确认，在这些代表基质样品的添加回收中，喹啉铜色谱峰的信噪比(S/N)均大于10，可以准确的进行喹啉铜的定性和定量，因此最后确定方法的定量限(LOQ)为0.1 mg/kg。根据前文已确定的条件，选择了番茄、梨、苹果、黄瓜和柿子作为实验基质，选择LOQ、0.5倍最大残留限量(MRL)、1倍MRL和2倍MRL共计4个水平，分别添加喹啉铜的标准品，每个水平进行了6个平行实验，结果见表2。

表2 喹啉铜在果蔬中的加标回收率(n=6)

(续表2)

MatrixAdded(mg/kg)Found(mg/kg)Recovery(%)RSD(%)Pear0.100.10090.4-11510.51.000.89485.4-93.53.722.001.7980.5-99.07.744.003.5885.0-98.85.49Apple0.100.088083.7-91.13.141.000.89986.0-1036.992.001.8183.0-93.54.204.003.8290.5-1003.27Cucumber0.100.090085.1-99.55.421.000.89282.8-95.55.912.001.7883.0-93.04.504.003.4483.0-90.03.90Persimmon0.100.095083.3-10912.11.000.87984.6-92.32.902.001.7182.5-99.07.964.003.3481.3-86.32.65

2.5 实际样品分析

目前，本方法已应用于日常检测工作。通过近两年来对近200个样品的检测工作，发现约有10个样品中喹啉铜残留量在0.1～0.2 mg/kg之间，没有检出不合格的产品。

3 结论

本文所建立方法已应用于蔬菜和水果中喹啉铜的日常检测工作，填补了我国目前尚未出台任何相关检测喹啉铜标准的技术空白。通过近两年来对大量样品中喹啉铜的检测工作，证实了该方法稳定有效，并通过监控数据，对生产基地进行用药指导，有效避免了由于蔬菜、水果中喹啉铜残留可能发生的贸易摩擦和损失。