QuEChERS-高效液相色谱-串联质谱法同时分析蜂蜜中33种生物碱

杜凤君， 徐敦明*， 张志刚， 林玉萍， 林立毅，赖国银， 赵海军， 刘 舟， 王 娟， 吕美玲

(1.厦门海关技术中心，福建厦门 361026；2.厦门医学院，福建厦门 361023；3.安捷伦科技(中国)有限公司，北京 100102)

生物碱是一类具有含氮杂环结构的碱性物质，他们具有高效的药理作用和生理活性。临床上，治疗剂量的阿片类生物碱具有镇静、镇痛及抑制肠蠕动的作用；马钱子类生物碱具有治疗四肢麻木、痈疮肿毒、咽喉肿痛的功效；荷叶碱类生物碱具有清热解毒、降脂减肥、止血散瘀等作用[1 - 2]。然而，许多生物碱毒性极强，摄入毫克量级即可对人体造成伤害，具有致命性毒性。过量误食、误服含有毒生物碱类食物、药物将导致食物中毒或药物成瘾。例如，长期食用含阿片类生物碱的食物可产生成瘾性，严重时会造成神经系统、消化系统损伤；过量服用马钱子碱会导致中枢神经系统兴奋、反射亢进，造成中枢神经系统疲惫与麻痹而死亡，严重危害人体健康[3 - 4]。

蜂蜜是天然甜类物质，由蜜蜂采集植物花蜜酿造，故而花蜜种类决定了蜂蜜的品质。自然界中某些植物的花粉和花蜜中含有天然毒素的生物碱，比如吡咯里西啶生物碱和异喹咻类生物碱[5]。近年来，包括蜂产品在内的多种食品中生物碱中毒事件时有发生[6 - 8]，但目前国内对生物碱的研究并不多[9 - 10]。生物碱的测定方法主要有化学分析法、分光光度法、薄层色谱法、高效液相色谱法、高效液相色谱-串联质谱法等方法[11]。高效液相色谱-串联质谱法结合了液相色谱高效的在线分离能力和质谱的高选择性、高灵敏度，具有同时检测多种不同性质目标物的能力，在药物多残留分析中显示出越来越广阔的应用前景。火锅底料中吗啡、可待因、罂粟碱等阿片类生物碱可以采用QuEChERS法快速提取后，用液相色谱-串联质谱法进行准确测定；蜂蜜中倒千里光碱、克氏千里光宁等吡咯啶类生物碱可以采用强阳离子型固相萃取柱进行富集和净化，然后用高效液相色谱-串联质谱法进行定性和定量分析[9 - 10]。现有的液相色谱-串联质谱法大多只适用于检测化学性质相近的一类生物碱[12 - 14]，对化学性质差别巨大的多类生物碱同时检测尚未建立有效的检测方法。

本研究选取了结构差异显著，化学性质悬殊的33种生物碱为研究对象，旨在建立蜂蜜中多种类多类型生物碱的液相色谱-串联质谱测定方法。本方法操作简易、检出限低、灵敏度高、稳定性好，可以快速、准确地进行定性定量分析，从而为蜂蜜中有毒生物碱的安全评价提供依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1290 Infinity Ⅱ高效液相色谱仪-6470三重四极杆串联质谱仪(美国，Agilent公司)；漩涡混匀器(德国，IKA公司)；离心机(上海安亭科学仪器厂)。

33种生物碱标准品购自上海安谱科学仪器有限公司，中英文名称及CAS号详见表1。甲醇、乙腈(色谱纯，德国Merck公司)；甲酸(色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司)；实验用水由Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)制备。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制分别准确称取33种生物碱标准品适量(精确至0.1 mg)，置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制为1.0 g/L的标准储备液，于-20 ℃下避光保存。实验时根据需要，梯度稀释成标准工作液。

1.2.2 样品前处理准确称取5 g蜂蜜样品于50 mL离心管中，加入5 mL水，200 μL氨水，10 mL乙腈，混匀。然后加入NaCl至饱和，涡旋2 min，离心，移出上层有机相。下层水相再加入10 mL乙腈，涡旋2 min，离心，合并上层有机相。氮吹至干，用0.05 mol/L HCl-甲醇=8∶2(V/V)定容至2 mL。在定容液中加入0.2 g PSA粉末，涡旋混匀1 min，以15 000 r/min离心3 min。上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤后，待测。

1.2.3 液相色谱-质谱条件色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18柱(50 mm×3.0 mm，1.8 μm；美国Agilent公司)，流动相A：0.1%甲酸水溶液；流动相B：甲醇。梯度洗脱程序：0.0～1.0 min，40%B;1.0～3.0 min,40%～60%B,3.0～5.0 min,60%～70%B;5.0～5.1 min,70%～90%B;5.10～10 min，90%～100%B;10.0～12.0 min，100%B；流速：0.2 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：10.0 μL。离子源：电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描方式；雾化气温度300 ℃，干燥气流速8.0 L/min，雾化器压力35 psi，鞘流气温度400 ℃，鞘流气流速12.0 L/min，毛细管电压3 500 V，喷嘴电压500 V。33种生物碱的保留时间、定性离子、定量离子、碰撞能量和碎裂电压等参数见表1。

表1 33种生物碱的保留时间、定量离子、定性离子、碰撞能量和碎裂电压等参数

(续表1)

No. CompoundCAS No.Retention time(min)Precursorion(m/z)Production(m/z)Fragmentor(V)Collision energy(eV)15Protopine130-86-95.664354.4149.0,189.0∗16029,4116Ephedrine hydrochloride50-98-67.491202.6127.1,144.1∗11045,2117Pilocarpine hydrochloride54-71-76.271245.7189.0,216.0∗34057,4918Retrorsine480-54-63.879352.441.2,67.2∗14577,5319Senecionine130-01-86.290336.4292.1,320.0∗16033,3320Monocrotaline315-22-03.425326.4193.9,120.0∗12033,4021Scopolamine51-34-33.832303.8137.9,156.1∗12023,1522Tetrahydropalmatine2934-97-65.729355.473.1,189.0∗15030,3023Coptisine chloride6020-18-45.699356.8165.1,193.0∗14525,4024Benzoylaconine466-24-07.253604.7554.3,105.0∗20541,6125Sophoridine6882-68-43.429249.4131.1,149.2∗19045,4126Evodiamine518-17-26.293304.4216.0,289.0∗27065,3727Chelerythrine34316-15-98.967349.4219.1,305.1∗15550,3028Colchicine64-86-88.039399.9309.9,358.1∗13532,2229Strychnine57-24-94.072334.9156.1,184.1∗13555,4430Pseudoephedrine hydrochloride345-78-83.948166.0133.0,148.1∗8014,1031Camptothecin7689-3-48.913348.8249.0,305.0∗13533,2532Antu86-88-47.490208.8186.0,144.1∗13520,2033Atropine51-55-84.347290.093.0,124.1∗13535,26

*quantitative ions.

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

生物碱是一类具有含氮杂环结构的碱性物质，酸性条件下含氮结构单元容易被质子化，适合采用电喷雾正离子多反应监测模式进行测定。本文考察了水-甲醇、水-乙腈、0.1%甲酸水-甲醇、0.1%甲酸水-乙腈4种流动相的分离效果。实验发现，乙腈对生物碱的洗脱能力比甲醇强，以乙腈为流动相时所有目标物在3 min内被全部洗脱，流动相的酸化与否不会造成出峰时间的变化。大多数生物碱在甲醇中的响应大于乙腈中的响应，鬼臼毒碱、10-羟基喜树碱、茄碱、秋水仙碱、可的松、喜树碱、安妥等在乙腈中响应比在甲醇中的高；同时，水相使用甲酸酸化后，各目标化合物峰都比使用未酸化的水相具有更高的响应。生物碱标准品混合溶液(50 μg/L)的总离子流色谱图见图1。

图1 33种生物碱标准品混合溶液(50 μg/L)总离子流(TIC)色谱图Fig.1 TIC chromatograms of 33 alkaloids standard solution

2.2 提取条件的选择

生物碱具有环状结构，能溶于有机溶剂，与酸成盐后能溶于水。根据生物碱的溶解特性及两性结构，本文考察了乙腈、乙醚、乙酸乙酯的提取效果。取三试管，分别称取5 g蜂蜜，加入5 mL水，加入生物碱标准工作液0.5 mL，加入200 μL氨水，加入NaCl至饱和后，分别采用10 mL乙腈、乙醚、乙酸乙酯提取，涡旋混匀，5 000 r/min离心，取上清液过膜上机，不同提取溶剂回收率见图2。图2表明提取效率：乙腈>乙醚>乙酸乙酯，后续的研究采用乙腈作为提取溶剂。

图2 不同提取液对33种生物碱回收率的影响Fig 2 Effect of extraction on the recoveries of 33 alkaloids*1-33：The serial number of compound is the same as Table 1.

2.3 净化方法的选择

本文考察了PSA粉末、C18粉末、MCX小柱、HLB小柱对样品的净化效果。称取适量试样4份，2份供基质分散固相萃取(QuEChERS)净化，2份供固相萃取小柱净化。在样品中加入50 μL生物碱标准中间液，混匀，加入NaCl至饱和，加入10 mL乙腈，涡旋，离心，取上清液。残渣再加入10 mL乙腈，涡旋，离心，合并有机相，氮吹至干，用0.05 mol/L HCl-甲醇=8∶2(V/V)定容至2 mL。一份加入0.2 g PSA粉末，一份加入0.2 g C18粉末，涡旋，离心，过膜后，上机测定。一份过MCX小柱，一份过HLB小柱，洗脱液氮吹至干，用0.05 mol/L HCl-甲醇=8∶2(V/V)定容至2 mL。定容液过膜备测。样品回收率见图3。盐酸麻黄碱、野百合碱、槐定碱、白屈菜红碱、安托在4种净化方式下回收率均小于50%，其余29种生物碱采用HLB小柱净化的回收率最差；采用C18粉末净化次乌头碱、荷叶碱、鬼臼毒碱、乌头碱、茄碱、苦参碱、喜树碱回收率不佳；采用PSA粉末、MCX柱净化各生物碱回收率水平相当，回收率在60%～120%之间。从节约实验时间、溶剂以及实验成本角度考虑，本实验采用PSA粉末进行净化。

图3 不同净化方式对33种生物碱回收率的影响Fig.3 Effect of clean-up methods on the recoveries of 33 alkaloids*1-33：The serial number of compound is the same as Table 1.

2.4 基质效应评价

基质效应是指在目标物测试过程中，由于其他物质的存在，造成目标物离子化过程受到增强或抑制，从而影响方法的准确度[17]。当前基质效应的评价方法有标准曲线法和相对响应值法。本文采用标准曲线法(基质效应=基质匹配溶液在线性范围内斜率/溶剂标准溶液在线性范围内斜率×100%)考察了生物碱在蜂蜜中的基质效应，用空白样品提取液为标准溶液的稀释溶液，使标准溶液和样品溶液具有相同的离子化条件。研究结果表明，喜树碱、10-羟基喜树碱、茄碱表现为基质增强效应(105%～110%)，其他目标物在基质中的都为基质抑制效应(60%～90%)，其中鬼臼毒素的基质抑制效应最为强烈(20%～60%)。

为了确保测定的准确性，消除基质干扰，本研究采用基体匹配法进行定量。用不含分析目标物的蜂蜜样品的提取液配制0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L系列标准溶液。以浓度(x，μg/L)为横坐标，定量离子峰面积(y)为纵坐标绘制标准曲线，最终得到33种生物碱的线性方程、相关系数，见表2。结果表明，在0.5～50 μg/L浓度范围内，33种生物碱均具有良好的线性关系。在蜂蜜基质中添加33种生物碱，考察方法的检出限(信噪比S/N=3)和定量限(信噪比S/N=10)，33种生物碱的检出限为0.33～6.7 μg/kg，定量限为 1.0～20 μg/kg(表2)。

表2 33种生物碱标准溶液的线性方程、相关系数、检出限及定量限

2.5 方法的回收率和精密度

加标回收和精密度实验，添加2、4、20 μg/kg 3个浓度水平目标物，重复6次测定，其平均回收率和相对标准偏差见表3。新乌头碱、次乌头碱、番木鳖碱、荷叶碱、鬼臼毒碱、乌头碱、槟榔碱、毛果芸香碱、钩吻碱、毒扁豆碱、茄碱、D -四羟基药根碱、去氢骆驼蓬碱、苦参碱、原阿片碱、盐酸匹鲁卡品、惹桌碱、千里光碱、东莨菪碱、延胡索乙素、盐酸黄连碱、苯甲酰乌头原碱、吴茱萸碱、秋水仙碱、士的宁、盐酸伪麻黄碱、喜树碱、阿托品28种生物碱回收率范围为64.5%～100.2%，相对标准偏差在4.7%～14.6%之间，方法回收率和精密度良好。盐酸麻黄碱、野百合碱、槐定碱、白屈菜红碱、安妥5种生物碱的回收率低，无法满足相关技术要求，但可以做为定性分析。

表3 33种生物碱在蜂蜜中的回收率和相对标准偏差(n=6)

(续表3)

No.CompoundRecovery(%)RSD(%)10Eserine81.8-96.77.511Solanine74.4-83.95.212Tetrahydrojatrorrhizine73.3-86.37.513Harmine72.7-90.110.314Matrine61.2-79.410.715Protopine74.4-94.211.016Ephedrine hydrochloride6.0-8.615.117Pilocarpine hydrochloride71.4-87.29.618Retrorsine68.8-89.611.119Senecionine68.7-91.113.520Monocrotaline11.9-18.67.421Scopolamine85.6-97.75.822Tetrahydropalmatine73.0-86.99.123Coptisine chloride77.3-91.711.624Benzoylaconine67.0-85.612.125Sophoridine18.7-25.7141.426Evodiamine68.2-89.112.427Chelerythrine5.5-13.410.628Colchicine81.4-98.69.829Strychnine83.0-91.14.130Pseudoephedrine hydrochloride68.8-85.59.331Camptothecin73.5-90.19.832Antu6.19-7.510.133Atropine86.3-93.73.6

2.6 实际样品的检测

根据本文建立的方法，对20个市售蜂蜜样品中的生物碱进行测定。其中，6个样品中检出生物碱，6个样品中检出了野百合碱，有3个样品还检出千里光碱。由于本方法对野百合碱的回收率低，定量不准确，但定性准确，可判定6个样品中含有野百合碱。

3 结论

本文建立了高效液相色谱-串联质谱测定蜂蜜中33种有毒生物碱的方法。在0.5～50 μg/L浓度范围内，33种生物碱均具有良好的线性关系，其检出限分别在0.33～6.7 μg/kg和1.0～20 μg/kg范围。对蜂蜜基质中进行2、4、20 μg/kg 3水平的加标回收试验，经基质匹配标准曲线校正，33种生物碱中28种的回收率范围为64.5%～100.2%，相对标准偏差在4.7%～14.6%之间，方法回收率和精密度良好；5种的回收率低，无法满足相关技术要求，只能定性分析。本方法操作简单，灵敏度高，可以快速地进行定性和定量分析，从而为蜂蜜中有毒生物碱的安全评价提供依据。