基因兴奋剂检测方法研究进展

王嘉禹， 赵美萍*

(北京大学化学与分子工程学院，北京 100871)

1 前言

在许多遗传性疾病及其它由于基因缺陷或异常导致的疾病的前瞻性治疗中，基因治疗具有相当重要的意义[1]。基因治疗通过将外源遗传物质直接导入人体内，或者通过上调(或下调)一些缺失(或有害)基因的活性[2]，纠正或补偿基因异常导致的病理变化，从而达到治疗效果。然而，利用相同的方法，运动员也可以提高某些特定蛋白质的内源性表达水平，以达到提高运动成绩的目的[2 - 3]。这种以非治疗目的，利用基因、遗传物质转移或利用正常或基因修饰细胞，不正当地达到提高运动成绩的效果的物质或者技术，被称为基因兴奋剂(Gene Doping)[4]。基因兴奋剂的使用不但严重违背了竞技体育精神，还可能对运动员身体造成严重损害。由于导入基因与生理基因的一致性，针对基因兴奋剂的检测相对于药物兴奋剂检测而言更加困难。本文简要介绍了基因兴奋剂的潜在候选基因、导入途径与载体和基因兴奋剂的危害，重点评述了目前已有基因兴奋剂检测方法及其缺陷，并对基因兴奋剂检测领域未来急需解决的问题进行了讨论。

2 基因兴奋剂简介

2.1 基因兴奋剂潜在的候选基因

人类基因组中至少有一百个染色体位点与运动表现相关[5]，这些基因位点均有可能作为潜在的基因兴奋剂目标。其中有些基因被视作基因兴奋剂的最佳候选者，得到了广泛研究[6]。这些目标基因表达的蛋白有促红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)、胰岛素样生长因子-1(Insulin-like Growth Factors-1，IGF-1)、血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)、人体生长激素(Human Growth Hormone，hGH)、肌肉生长抑制素(Myostatin)和过氧化物酶体增殖剂激活受体(Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-δ，PPAR-δ)等[3,6]。表1列出了几种重要的基因兴奋剂候选者以及它们在人体中起到的作用[3,6]。

2.2 基因兴奋剂的导入途径与载体

与基因治疗一样，基因兴奋剂操作中最为关键和最具挑战性的步骤之一是将靶基因导入特定的宿主细胞中。这一过程可以通过体内(In vivo)注射法或体外(Ex vivo)培养法两种方式进行，这两种途径如图1所示。体内注射法是将重组了靶基因的基因载体直接通过肌肉注射的方式导入到机体的特定部位，这些

表1 潜在的基因兴奋剂候选者及其性质

基因载体包括了一些病毒载体、质粒以及脂质体等。体外培养法则是先将重组的基因载体导入体外培养的宿主组织细胞中，随后再将这些组织细胞转移回宿主体内从而发挥作用[7]。与体外培养法相比，体内注射法操作相对简便，基因转导效率更高，且成本相对较低[6]。目前而言，体内注射法的应用更为普遍，也更加成功。但体内注射法也伴随着存在免疫反应、难以控制基因整合和基因表达等缺点[3,8 - 9]。

图1 基因兴奋剂的两种导入途径[6 - 7]Fig.1 Two strategies of gene doping[6 - 7]

无论是体内途径还是体外途径，基因载体作为基因治疗或基因兴奋剂操作步骤中的一个重要工具，得到了非常深入的研究。病毒作为一种高度进化的生物机器，能够高效地将遗传物质导入细胞核中。研究人员据此开发了多种类型的带有复制缺陷的病毒载体系统，并在临床试验中对它们的效率、特异性和安全性进行测试[10]。病毒载体可分为整合型病毒载体和非整合型病毒载体两类[9]。其中，整合型病毒载体，如慢病毒(Lentivirus)等，在进入细胞后会将其基因组整合到宿主细胞的染色体上；而非整合型病毒载体，如单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus，HSV)、腺病毒(Adenovirus)及腺相关病毒(Adeno-Associated Virus，AAV)等，在进入细胞核后其基因组保持在宿主细胞的染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中[9]。近年来，重组AAV(Recombinant AAV，rAAV)和慢病毒载体系统在许多临床试验中表现出了优越的转导效率和安全性[11 - 12]。而对于非病毒载体而言，由于质粒或质粒-脂质体复合物等载体存在着转导效率低、基因表达多变、易被降解或清除等缺点，限制了它们的应用[3,9]。不过，相比于病毒载体，非病毒载体具有低成本、低免疫原性、高装载容量以及易于规模化生产等优点[13]，有着较为广阔的应用前景。

目前基因治疗虽然已经获得了一定程度的进展，但也存在着一些尚未解决的问题。在解决这些问题之前，基因治疗是无法在临床上开展大规模的使用的。不幸的是，基因兴奋剂由于其本身的非法属性，在使用过程中不受安全法规的约束[14]，因此使用者会面临着多种巨大的风险。首先，无论是使用的病毒载体还是通过基因兴奋剂表达出的蛋白都有可能引发严重的免疫反应。1999年，一名18岁的患者在全身注射高免疫原性的腺病毒载体后，由于体内发生的对病毒载体的免疫应答而死于器官衰竭[9,15]。虽然改进后的病毒载体免疫原性较低，但通过外源基因表达出的蛋白质与天然蛋白之间微小的结构差异也可能引发病理反应，例如在动物实验中对猕猴转入外源EPO基因却导致这些猕猴患上了自身免疫性贫血[16 - 17]。其次，在基因治疗或基因兴奋剂中，对外源基因表达的控制是非常困难的。蛋白质的过量表达或者是由于过量蛋白的积累所导致的毒性同样都有危害性[3]。另外，虽然并非所有病毒载体都会进行基因整合，但对于采用整合型病毒载体进行的基因治疗/基因兴奋剂而言，基因整合有可能造成抑癌基因断裂，也可能导致原癌基因形成，从而提高患癌的风险[3]。除上述提到的风险外，基因治疗还存在着长期的或潜在的危害以及伦理道德上的争议。

尽管基因兴奋剂存在上述种种风险与局限，一些案例表明在竞技体育运动员的团队中有人准备使用制药或生物技术发明[18]。目前尚未有证据表明有运动员采用了基因兴奋剂来提高自己的运动成绩。但随着基因治疗的进一步进展，用于基因兴奋剂的基因治疗方法可能会变得更有吸引力[9]。因此，在世界反兴奋剂机构(World Anti-Doping Agency，WADA)将基因兴奋剂列入禁止名单[4]的同时，在常规兴奋剂检测中增加可靠的、合法的、具有预防性质的基因兴奋剂检测项目也是至关重要的。

3 基因兴奋剂的检测方法

自1968年奥运会开始实施兴奋剂检测以来，已经发展了大量的直接或间接检测兴奋剂和方法。直接检测方法旨在鉴定尿液或血液等体液中的违禁物质及其代谢产物，而间接检测方法的目标则是监控服用或使用兴奋剂后造成的一些生理变化，如表达差异、免疫反应及代谢变化等。通常而言，直接检测法比间接检测法更受青睐，但同时也存在着一些直接检测法无法实施的情况，例如检测与内源表达产物相同的物质，或某些由于代谢太快而无法检测到的物质，此时就需要采用间接的方式进行检测[3]。

相比于药物兴奋剂，基因兴奋剂的检测更为困难。这是由于基因兴奋剂导入的外源基因与生理DNA的高度一致性，采用非侵入性的直接检测方法难以进行鉴定[19]。而试图检测基因载体的间接检测方法，即使能基于身体的免疫反应(例如对腺病毒或其它载体的免疫应答)进行检测，常常也难以区分该免疫反应是源于自然感染还是人为导入的病毒[2]。不过近些年来研究人员也发展出了一系列直接或间接的检测基因兴奋剂的方法，以下将对一些代表性方法做简要的介绍。

3.1 检测外源基因表达的蛋白质

2004年，Lasne等[20]对猕猴通过肌肉注射了含有EPO cDNA(complementary DNA)的AAV载体后，发现病毒转染前后猕猴血清中EPO蛋白同源异构体(Isoform)的等电聚焦图谱发生改变。经过分析，研究者认为这是由于不同细胞及组织表达的EPO蛋白糖基化水平不同所导致[20]。虽然能否将这一针对EPO基因兴奋剂的检测结果应用于人体仍处于假设阶段，但对人体生长激素(hGH)同源异构体的检测已经能够用于人类hGH基因兴奋剂检测。该方法基于对血浆中hGH两种同源异构体(22 kDa与20 kDa)的定量检测，如果基因兴奋剂采用的是分子量为22 kDa的hGH，那么这两种同源异构体的比例变化就能够被检测到[21]。不过这种比例变化相对于自然比例而言是否足够明显目前尚不清楚[9]。更重要的是，这种针对外源导入基因表达出的蛋白进行检测的原理并不适用于所有的基因兴奋剂候选蛋白。首先，为了满足该检测方法，该基因兴奋剂候选蛋白必须存在翻译后修饰的过程，且能够在血液中被检测到[9]。它并不适用于那些以内源形式在同一组织中表达的蛋白质，比如胰岛素样生长因子-1(IGF-1)，机械生长因子(Mechano Growth Factor，MGF)等，也不适用于不发生翻译后修饰或只发生少量翻译后修饰的蛋白[19]。

3.2 检测外源导入基因序列

天然的基因组DNA(genomic DNA，gDNA)含有外显子和内含子，经过RNA剪接后，外显子区域的序列被保留下来并被表达为蛋白质。而出于基因载体系统的安全性考虑以及载体容量的限制，外源导入的转基因(transgenic DNA，tDNA)往往只含有外显子，而没有内含子区域。因此，检测到不含内含子序列的基因即可作为外源基因或使用基因兴奋剂的证据[6]。研究人员据此设计了一系列与外显子-外显子连接处特异性结合的DNA引物，利用PCR技术对外源tDNA进行检测[9]。其原理如图2所示[22]，当tDNA序列存在时，由于其不含内含子序列，这些与外显子连接处结合的DNA引物便能同外源导入基因序列结合，从而发生特异性扩增，而gDNA由于存在内含子的阻隔无法与DNA引物结合，也就无法进行扩增。

图2 利用PCR检测转基因DNA方法原理[22]Fig.2 Principle of transgenic DNA detection by PCR[22]

图3 人类VEGF-A基因组结构和转基因巢式引物策略[26]Fig.3 The genomic structure of human VEGF-A and transgene nested priming strategy.[26]

Beiter等[22]利用该原理发展了一套单拷贝引物内部跨内含子PCR(single-copy primer-internal intron-spanning PCR，spiPCR)系统，成功实现了基因组DNA背景下EPO tDNA和VEGF tDNA的单拷贝检测。Ni等[23]和Baoutina等[24 - 25]采用定量PCR(quantitative PCR，qPCR)的方法对血清中EPO tDNA进行检测。Ni和Guiner等[23]发现对非人类灵长类动物肌肉注射质粒载体或rAAV载体后，能在血液中检测到较高浓度的tDNA，且rAAV基因组能在白细胞中长期存在(维持57周)。另外，Beiter等[26]和Moser等[27]又在检测体系中引入巢式PCR(nested PCR)的方法，其原理如图3所示[26]。巢式PCR使用两对DNA引物进行两次PCR扩增，第二对引物结合在第一次PCR产物内部，减少了错误片段扩增的几率，因此相比于常规PCR，巢式PCR特异性更高，灵敏度也更高，适用于基因兴奋剂的长期检测[9]。Beiter等[26]利用巢式PCR在基因组DNA背景下实现了对VEGF、IGF-1、EPO、FST(follistatin，卵泡抑素)及GH-1外源cDNA两个拷贝数的检测，并在小鼠模型中证实了该方法的可行性。Neuberger等[28]则建立了检测EPO转基因的定量巢式PCR方法，在肌肉注射基因载体8至14周的猕猴白细胞中检测到了病毒载体的存在。除此之外，Moser等[29]还引入数字液滴PCR(digital droplet PCR，ddPCR)的方法对小鼠全血样品中IGF-1 cDNA进行检测。

除PCR技术以外，Salamin等[30]还提出可以利用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification method，LAMP)对基因兴奋剂进行检测。然而，这些基于外源导入基因含有外显子-外显子连接序列的检测方法也是相对容易躲避的。随着基因治疗技术的发展，加上这一检测原理逐渐被人所知，对外源导入基因序列进行稍许改动，或者引入同义突变位点，或者在外显子之间插入内含子等方法均有可能被发展出来，造成假阴性结果[31]，从而躲避基于这种原理的检测。

近些年来，二代测序(Next-Generation Sequencing，NGS)技术得到了广泛的应用，并为全基因组测序提供了快速可行的方法。NGS技术可以有效地应用于监测转基因生物(Genetically Modified Organisms)[32]，且从原理上可以检测到所有种类的基因兴奋剂。因此，NGS看上去是一种非常有前景的基因兴奋剂检测方法。然而有一些因素限制了NGS技术的适用性。根据动物与人类的生物体内分布研究表明，血清中转基因分子的可检测性只能维持几天或几周，而在血细胞中转基因可检测性则可以持续数月甚至数年[26,33 - 34]。而由于全血样品中高水平gDNA背景的存在，所需的测序覆盖度不适用于NGS，因此还需要进行靶向测序或者在测序之前进行PCR预扩增，增加了检测成本与检测所需时间[9]。de Boer等[31]采用了靶向二代测序的方法对潜在的基因兴奋剂EPO、IGF1、IGF2、GH1及GH2等cDNA进行检测，成功检测到了上述cDNA所有的外显子-外显子连接区域序列，以及相关的启动子序列和质粒序列。

3.3 检测基因载体

通过检测基因载体本身来鉴定是否使用了基因兴奋剂从理论上讲不失为一种可行的方案，但这种方法实施起来相当困难。首先，对于病毒载体来说，被试者很可能通过其它途径受到病毒感染，比如腺病毒有多种在人群中流行的血清型，而不同病毒载体在体液中持续时间也不尽相同。而对于质粒载体而言，因为质粒DNA在血浆中半衰期极短，极大地限制了在循环系统中检测质粒载体的机会。在小鼠静脉注射质粒载体30 min后，血浆中检测到的质粒DNA仅占输入质粒DNA的0.3%至13%[19]。上述问题都使得通过检测基因载体来监测基因兴奋剂的方法存在较大的局限性。

3.4 间接检测方法

除了上文提到的直接检测法以外，还发展了一些间接检测基因兴奋剂的方法[3,6]。通过评估宿主对病毒载体、引入的DNA序列或者表达出的转基因蛋白本身的免疫反应，可以辅助判断是否使用了基因兴奋剂[3]，但这些免疫反应也有可能是宿主受到其它途径的病毒感染导致，由此从血液中检测到的抗体就有可能造成假阳性的结果[6,9]。另外，通过长期监测运动员的表达图谱、蛋白质图谱或代谢图谱也有助于得到有关基因表达发生变化的相关信息，然而这一方案则需要建立庞大的相关信息数据库，同时也存在着假阳性的可能[9]。

综上所述，虽然目前已经发展出了一系列基因兴奋剂的检测方法，但其中较有实用价值的方法只有检测转基因蛋白和转基因序列两种。其中，检测转基因蛋白的方法并不适用于所有基因兴奋剂候选蛋白，而检测转基因序列的方法无法用于含有内含子序列的外源基因上。

4 染色体步移技术

如前文所述，目前发展出的基因兴奋剂检测技术，特别是针对外源基因序列的检测方法，其原理主要通过PCR等扩增技术对已知的一些基因兴奋剂候选基因进行定性或定量检测，以判断是否存在外源导入的基因。而与这些基因序列相邻的侧翼序列，可能是一些基因载体上的序列，也是经过基因整合进入染色体上的序列都是未知的，且无法通过上述PCR等扩增技术获取相关信息。而染色体步移技术(Genome Walking，GW)便是通过已知序列的基因片段来获取该片段侧翼未知序列信息的方法[35]。根据不同原理，染色体步移技术主要可分为反向PCR(inverse PCR，I-PCR)、连接介导PCR(ligation-mediated PCR)及随机引物PCR(randomly primed PCR)等不同种类[36]。

图4 反向PCR原理[37]Fig.4 The principle of inverse PCR[37]

4.1 反向PCR

1988年，Triglia等[37]以及Ochman等[38]首次提出反向PCR的概念，并用该方法对已知DNA区域两侧的未知序列进行扩增，其原理如图4所示[37]。在进行反向PCR时，首先选择在已知序列区域没有酶切位点的限制性内切酶，尝试水解在其两侧的未知序列区域内可能存在的酶切位点，产生粘性末端。之后在DNA连接酶的作用下，将序列两边酶切后产生的末端相互连接形成环状DNA。最后再根据已知序列设计的反向PCR引物进行扩增，通过测序即可得到已知序列上下游侧翼未知区域的序列信息[37 - 38]。不过，由于侧翼区域序列未知，经过限制性内切酶水解后得到的DNA片段长度难以把握，因此需要多次设计实验才能获得目标基因的全长信息。另外，由于环化过程也较难控制，非常容易得到由不同酶切片段形成的线性连接产物，造成非特异性扩增。

Tsaftaris等[39]在反向PCR的基础上进一步引入滚环扩增(Rolling Circle Amplification，RCA)的思路。经过T4连接酶连接形成的环状双链DNA作为模板，在Phi29 DNA聚合酶的作用下发生滚环扩增，然后再以滚环扩增产物作为模板通过反向PCR对未知区域序列进行扩增及测序，对藏红花(Crocus Sativus)的启动子区域序列进行了鉴定[39]。Thorsen等[40]利用该方法对白血病患者骨髓DNA样品进行检测，鉴定出了TAF15-ZNF384及BCR-ABL1两种融合基因，显示了该方法在检测染色体断裂点和由新的染色体易位引起的融合基因上的适用性。

4.2 连接介导PCR

1989年，Mueller等[41]和Pfeifer等[42]提出了连接介导PCR的方法。连接介导PCR是指在限制性内切酶对目标DNA酶切后，在酶切产物末端连接已知序列的接头。然后根据两端接头序列设计引物进行PCR，最终获得目标DNA序列。不过，可以预见，连接介导PCR在研究复杂样品时会产生大量非特异性扩增产物[35]。为了解决这一问题，研究人员开对连接介导PCR进行了多种不同的改进。Rosenthal等[43]和Lagerstrom等[44]开发了捕获PCR(capture PCR)的方法。通过连有生物素标记的引物首先进行单向PCR，然后利用链霉亲和素包被的磁珠富集带有生物素的PCR产物单链，最后通过无标记的接头引物进行第二次PCR得到目标片段序列。由于该方法利用了生物素标记的特异性引物，因此极大提高了连接介导PCR的特异性。与此同时该方法操作则更加繁琐，成本也相应提高[43]。此外，步降PCR(step down PCR)[45]，T-linker特异性PCR(T-linker-specific ligation PCR)[46]等方法也被相继开发出来用于获取未知基因序列。

4.3 随机引物PCR

与上述两种方法不同，随机引物PCR无需复杂繁琐的限制性内切酶酶切、连接等操作步骤，而是通过设计随机引物与特异性引物组合的方式对未知序列基因进行扩增，主要有单边PCR(one-sided PCR)及热不对称交错PCR(Thermal Asymmetric Interlaced PCR，TAIL-PCR)等[47]。不过，随机引物PCR虽然不需要进行酶切、连接等操作，却要求更加复杂的引物设计以及操作繁琐的PCR步骤。另外，由于该方法存在随机引物的非特异性结合作用，在进行PCR扩增时会逐步积累大量的非特异性产物。

5 总结与展望

基因治疗技术的发展也带来了基因兴奋剂的滥用问题，而在限制基因兴奋剂的使用上，建立基因兴奋剂的检测方法则显得至关重要。在目前提出的一系列基因兴奋剂检测策略中，检测外源基因表达蛋白的策略能够检测EPO基因兴奋剂，但并不适用于所有基因兴奋剂的候选基因蛋白。而检测外源基因序列的策略能够检测无内含子的外源导入基因，并且已发展出多种检测模式，包括实时定量PCR[23 - 25]、巢式PCR[26 - 28]、数字液滴PCR[29]、环介导等温扩增[30]及二代测序[32]等，实现了对生物体内外源导入基因的长期检测。不过，通过引入同义突变位点或在外显子间插入内含子等方法对基因兴奋剂进行改动即可逃避该类方法的检测，限制了这一检测策略的使用。另外，检测基因载体或免疫反应等策略容易受到自然病毒的干扰，从而导致假阳性结果。

综上所述，虽然目前已经发展出了一些基因兴奋剂的检测方法，但只有少数检测策略具有较高的实用性，同时也存在一定的局限性。因此，还需要继续开发新的更简便、高效的检测方法，为杜绝基因兴奋剂的滥用提供强有力的监控手段。