酶法催化酯交换制备甘油二酯工艺优化研究

马靖轩，马传国,2,3，李利君,2,3，刘 伟，刘 君,2,3

(1.河南工业大学粮油食品学院，郑州 450001； 2.小麦和玉米深加工国家工程实验室,郑州 450001；3.国家粮食局粮油食品工程技术研究中心，郑州 450001)

甘油二酯是油脂中的天然物质，但在常见的普通油脂中含量较少[1]。甘油二酯的代谢途径与甘油三酯不同，甘油二酯可以减少动物和人体内的脂肪积累，对肥胖及与体重相关的疾病有益[2]。此外，甘油二酯可作为食品级乳化剂，被广泛应用于食品、医药和化妆品等领域[3]。甘油二酯的制备方法主要有化学法[4- 5]和生物酶法[6-7]两种。化学法存在反应温度较高、催化剂专一性较差、甘油二酯含量低、能耗大以及环境污染等问题[8]。生物酶法相比于化学法具有反应条件温和、专一性高、产物得率高、分离纯化简单、环境友好、固定酶可重复使用等优点，是最有应用前景的生产工艺[9-10]。

酯交换法可以引入原料油中含量较低的脂肪酸种类，在催化剂的作用下发生酰基交换或者脂肪酸重排,是改善油脂物理性质的有效方法之一。采用酶促酯交换反应具有能耗低、条件温和、副产物少等优点。因此，本实验以大豆油和单甘酯为原料，在无溶剂体系中利用固定化脂肪酶Novozym 435催化制备甘油二酯，考察了反应温度、底物摩尔比、反应时间、酶添加量4个因素对甘油二酯含量的影响，并进行了响应面优化实验，旨在为酯交换制备甘油二酯的工业化生产提供一定的研究基础和参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

一级大豆油，许昌邦迪蛋白有限公司；单甘酯，佳力士添加剂有限公司；无水硫酸钠，分析纯；正己烷，色谱纯；固定化脂肪酶Novozym 435，诺维信(中国)生物技术有限公司。

DF-101Z 集热式恒温加热磁力搅拌器，AUY-220 型电子分析天平，S25涡旋仪，Agilent 7890B 气相色谱仪。

1.2 实验方法

1.2.1 酯交换制备甘油二酯

称取一定摩尔比的大豆油与单甘酯于50 mL圆底烧瓶中搅拌加热，待达到预定温度后，加入一定量的固定化脂肪酶Novozym 435，反应一定时间后停止加热。将反应后的混合物离心使酶与粗产品分离，得到的上层油相即为富含甘油二酯的酰基甘油混合物。

1.2.2 甘油酯组成测定

取100 μL样品，加入2 mL色谱级正己烷，涡旋混匀溶解后，加入适量无水硫酸钠，用1 mL注射器吸出溶液，经过孔径0.45 μm 针式过滤器过滤，打入气相小瓶中备用，待气相色谱分析。

气相色谱分析条件: 氢火焰离子化检测器；DB-1ht 毛细管柱(30 m × 250 μm × 0.1 μm)；升温程序为柱温100℃保持0 min，50℃/min 升温到220℃保持0 min，15℃/min 升温到290℃保持0 min，40℃/min升温到320℃保持8 min，20℃/min升温到360℃保持8 min；进样口温度350℃；分流比40∶1；检测器温度400℃；高纯氮气流速3.79 mL/min；氢气流速50 mL/min；空气流速300 mL/min。各组分含量采用面积归一化法计算。

1.2.3 脂肪酸组成测定

样品中脂肪酸采用三氟化硼甲酯化后[11]，进行气相色谱分析。

气相色谱分析条件：HP-88毛细管色谱柱(100 m×250 μm×0.2 μm)；载气为纯度99.999%氮气；柱初温140℃，保持5 min，4℃/min升温至240℃，保持20 min；进样口温度260℃；柱流量1.0 mL/min；分流比50∶1；进样量1 μL；检测器温度260℃；氢气流量45 mL/min；空气流量400 mL/min。

1.2.4 理化指标测定

酸价，按GB 5009.229—2016测定；过氧化值，按GB 5009.227—2016测定；皂化值，按GB/T 5534—2008测定；碘值，按GB/T 5532—2008测定；水分及挥发物含量，按GB 5009.236—2016测定。

将上述参数设置之后，将设计的PLC程序重新烧录到PLC中，将组态监控程序烧录到触摸屏中。用MPI电缆将两设备连接，再次通讯，通讯成功触摸屏界面数值显示窗口的数据显示为“00000”。

2 结果与讨论

2.1 原料理化指标及脂肪酸组成

大豆油理化指标见表1，大豆油及单甘酯的脂肪酸组成及含量见表2。

表1 大豆油理化指标

注：“-”表示未检出。

表2 大豆油和单甘酯脂肪酸组成及含量 %

由表2可知，大豆油以不饱和脂肪酸为主，其中油酸和亚油酸占比接近80%。单甘酯以饱和脂肪酸棕榈酸和硬脂酸为主。

2.2 酯交换制备甘油二酯的单因素实验

2.2.1 反应温度的影响

在大豆油与单甘酯摩尔比1∶1、酶添加量5%、反应时间8 h条件下，考察反应温度对甘油二酯含量的影响，结果如图1所示。由图1可见，反应温度从70℃升高到110℃过程中，酰基混合物中各组分的含量基本没有变化，这可能是因为一定范围内反应温度的升高降低了混合物的黏度，提高了底物之间的溶解度和扩散速率，有利于酶与底物的相互作用[12]。此外，由于脂肪酶Novozym 435是固定化酶，通常情况下，酶经固定化后热稳定性提高，其活性在较高温度下得到充分发挥，在这一温度范围内，酶的催化效率较高导致甘油二酯含量较高[13]。当反应温度达到120℃，甘油一酯和甘油三酯的含量明显增加，甘油二酯的含量明显降低。这是因为脂肪酶是具有生物活性的大分子物质，反应温度超过酶的最适温度，导致酶变性，酶的催化活性降低甚至失活，不易生成甘油二酯。考虑到实际生产的能耗，选择最佳反应温度为80℃。

图1 反应温度对甘油二酯含量的影响

2.2.2 大豆油与单甘酯摩尔比的影响

在反应温度80℃、酶添加量5%、反应时间8 h条件下，考察大豆油与单甘酯摩尔比对甘油二酯含量的影响，结果如图2所示。由图2可见，随着单甘酯添加量的增多，甘油二酯含量呈现先增加后趋于稳定的趋势，这可能是由于随着单甘酯的增多，脂肪酶催化合成甘油二酯比较容易，在大豆油与单甘酯摩尔比为1∶1后反应达到动态平衡。随着大豆油与单甘酯摩尔比的继续增加，甘油二酯含量基本不变，甘油一酯含量逐渐增多，甘油三酯含量逐渐减少，这也与甘油三酯添加量少，甘油一酯添加量越来越多有关。因此，选择最佳大豆油与单甘酯摩尔比为1∶1。

图2 大豆油与单甘酯摩尔比对甘油二酯含量的影响

2.2.3 反应时间的影响

在反应温度80℃、酶添加量5%、大豆油与单甘酯摩尔比1∶1条件下，考察反应时间对甘油二酯含量的影响，结果如图3所示。由图3可见，反应时间在2～6 h范围时，甘油二酯含量呈现缓慢上升的趋势，在2 h时已经接近40%，而甘油三酯含量略微下降，甘油一酯和脂肪酸含量随反应时间的变化较小。这可能是因为脂肪酶在80℃时催化活性高，反应效率高，短时间内大量生成甘油二酯。随着反应时间的继续延长，水解速率与酯化速率平衡，反应体系处于平衡状态，各物质含量变化较小[4]。因此，选择最佳反应时间为6 h。

图3 反应时间对甘油二酯含量的影响

2.2.4 酶添加量的影响

在反应温度80℃、大豆油与单甘酯摩尔比1∶1、反应时间6 h条件下，考察酶添加量对甘油二酯含量的影响，结果如图4所示。由图4可见，酶添加量从1%增加到5%时，甘油二酯的含量从35%左右增加到50%左右，甘油三酯含量则随着酶添加量的增加有明显下降的趋势，酶添加量为5%时，反应体系处于平衡状态。这可能因为酶添加量越多，酶分子活性部位与反应底物接触程度提高，酶促反应效率高，有利于反应进行。但是继续加大酶添加量，甘油二酯的含量变化不大，维持在45%左右，这可能是因为当酶添加量过多时，酶的活性部位过量，有可能导致蛋白的聚集作用而不再与底物接触[14]。因此，选择最佳酶添加量为5%。

图4 酶添加量对甘油二酯含量的影响

2.3 酯交换制备甘油二酯的响应面实验

2.3.1 实验方案设计和结果

根据单因素实验结果，利用Design-Expert软件设计响应面实验，对反应温度(A)、大豆油与单甘酯摩尔比(B)、反应时间(C)及酶添加量(D)4个因素，分别在3个水平上进行Box-Behnken组合设计，以甘油二酯含量(Y)为评价指标，建立数学模型，确定酯交换制备甘油二酯的最佳工艺参数。响应面实验因素水平见表3，响应面实验设计及结果见表4。

表3 响应面实验因素水平

表4 响应面实验方案设计及结果

2.3.2 回归方程方差分析

用 Design-Expert软件对表4的 29 组实验结果进行回归拟合，得到二次多元拟合回归方程：Y=46.93-7.76A+4.03B+6.09C+5.77D+6.46AB+5.79AC+1.07AD-4.94BC-5.19BD-5.33CD-7.33A2-2.95B2-3.36C2-3.99D2。

表5 方差分析

2.3.3 最优条件及验证实验

利用Design-Expert软件得到酯交换制备甘油二酯最优工艺条件为：大豆油与单甘酯摩尔比1∶2，反应温度82.9℃，反应时间6.4 h，酶添加量9%。在最优条件下，甘油二酯含量的预测值为52.8%。考虑到实际操作的可行性，调整工艺条件为：大豆油与单甘酯摩尔比1∶2，反应温度83℃，反应时间6.5 h，酶添加量9%。对调整的工艺条件进行验证实验，甘油二酯含量的平均值为(51.2±0.2)%。刘尊等[15]利用固定化脂肪酶 Lipozyme TL IM催化单甘酯和棕榈油(24℃)制备甘油二酯，在反应温度65℃、反应时间3 h、原料质量比2∶8、催化剂用量5%的条件下，产品中甘油二酯含量为26%。本研究采用的是非专一性固定化脂肪酶Novozym 435，耐热温度较高，有利于单甘酯与大豆油充分溶解；反应过程在无溶剂体系下进行，且只加入原料和固定化酶，绿色环保。此外，酯交换反应后的混合物容易快速结晶，应在高温下将固定化酶与油相分离。

3 结 论

本研究以一级大豆油和单甘酯为原料，在无溶剂体系下利用固定化脂肪酶Novozym 435催化酯交换制备甘油二酯，系统考察了酶法制备甘油二酯的主要参数，并基于响应面实验优化工艺条件，建立了良好的数学模型指导甘油二酯的合成。实验确定酯交换制备甘油二酯的最优条件为：大豆油与单甘酯摩尔比1∶2，酶添加量9%，反应温度83℃，反应时间6.5 h。在最优条件下，甘油二酯含量达(51.2±0.2)%。