乌头汤和改良乌头汤药代动力学-药效学动物实验比较

孙 瑜，田树成

（辽宁中医药大学附属第三医院，辽宁 沈阳 110003）

乌头汤出自《金匮要略》，由制川乌、麻黄、炙甘草、白芍、黄芪等中药组方，具有温经散寒、祛湿镇痛的功效，主要用于治疗风湿性关节炎、类风湿关节炎及强直性脊柱炎等[1-2]。名老中医李可在此基础上配伍黑豆、防风，以减少乌头毒性[3-4]。制川乌为乌头汤及改良乌头汤的君药，味辛、苦，性热，有大毒，具有抗炎、镇痛、免疫调节作用，临床常用于治疗风湿类疾病。制川乌含有的单酯型生物碱既是活性成分，又是毒性成分，主要表现为对神经、心脏的毒性[5-8]。本研究中采用超高效液相色谱-串联四级杆质谱（UPLC-MS/MS）技术分析乌头汤及改良乌头汤中单酯型生物碱化学成分在体内的变化规律及差异，探讨乌头汤中制川乌不同配伍时单酯型乌头生物碱含量的变化，并结合现代药效学对配伍增效减毒的作用进行阐述，为乌头汤的配伍研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与动物

仪器：UPLC-MS/MS 分析系统（包括Agilent 1290型高效液相色谱仪和Agilent 6460 型质谱检测器）；LG16-B 型高速离心机（北京雷勃尔离心机有限公司）；Vortex-Genie2 型涡旋振荡器（美国Scientific Industries公司）；1208BH 型超声波清洗器（德国Bandelin Sonorex RK 公司）；HWS 24 型电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）；Miui-Q 型超纯水机（美国Mililpore 公司）；AB265-S 型电子天平（瑞士Mettler Toledo）；PV-200 型足趾肿胀测定仪（成都泰盟软件有限公司）。

试药：甲醇、乙腈（美国ACS 恩科化学）；乙酸、乙酸铵（美国Sigma 公司），均为色谱纯；水为超纯水，其余试剂均为分析纯；完全弗氏佐剂（CFA）、角叉菜胶（批号为021M0036V）均购自美国Sigma 公司，临用时配成1%浓度的溶液。制川乌、麻黄、炙甘草、白芍、黄芪、黑豆、防风购于沈阳辽河药房，均经辽宁中医药大学附属第三医院田树成主任中药师鉴定为正品。苯甲酰乌头原碱对照品（批号为111794-201303），苯甲酰新乌头原碱对照品（批号为111795-201303），苯甲酰次乌头原碱对照品（批号为111796-201303），己酮可可碱对照品（批号为110736-201337），均购自中国食品药品检定研究院。

动物：清洁级雄性SD 大鼠96 只，体质量（270±30）g，许可证号为SCXK（黑）2013-001；昆明种小鼠48 只，普 通 级，体 质 量（20±2） g，许 可 证 号 为SCXK（ 黑）2015-010，均购自哈尔滨医科大学实验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 血液浓度检测方法

1）溶液制备

对照品溶液：取各对照品适量，精密称定，分别置容量瓶中，以甲醇溶解并定容，摇匀，得对照品溶液；精密吸取各对照品溶液置同一容量瓶中，甲醇定容至刻度，即得混合对照品溶液（苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱含量分别为5 ～5 000 ng/mL，2.5 ～2 500 ng/mL，2.5 ～2 500 ng/mL）。

供试品溶液：称取过60 目筛的制川乌、炙甘草、麻黄、黄芪、白芍各3.0 g，精密称定，置圆底烧瓶中，混合均匀，加10 倍量水浸泡30 min，水浴加热1 h（微沸），静置10 min，8 层纱布滤过，合并滤液；残渣加入8 倍量水，水浴加热1 h，静置10 min，8 层纱布滤过，合并滤液；旋蒸浓缩至半流动状态，得提取浸膏，为乌头汤浸膏（处方e）。改良乌头汤处方，根据老中医李可提出的在原乌头汤处方基础上配伍黑豆、防风，称取过60 目筛的制川乌、炙甘草、麻黄、黄芪、白芍、黑豆、防风各3.0 g，精密称定，制备方法同上，为改良乌头汤浸膏（处方b）。

标准曲线血浆样品及质控样品：精密吸取上述混合对照品溶液5 μL，加入空白血浆45 μL，涡旋30 s，配制成标准曲线血浆样品，苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱含量分别为0.5 ～500 ng/mL，0.25 ～250 ng/mL，0.25 ～250 ng/mL。

2）色谱条件

色谱柱：Waters ACQULTY UPLC C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：0.1%甲酸水溶液（流动相A）-乙腈（流动相B），梯度洗脱（0 ～2 min 时流动相A为95%→80%，2 ～3 min 时流动相A 为80%→70%，3 ～4 min 时流动相A 为70%→50%，4 ～5 min 时流动相A 为50；流速：0.35 mL/min；进样量：1 μL；柱温：30 ℃。

3）质谱条件

电喷雾离子源（ESI 源），正离子检测。扫描方式：多反应离子监测（MRM）；检测离子质荷比：苯甲酰新乌头原碱590.3→105.1，苯甲酰乌头原碱604.1→105.1，苯甲酰次乌头原碱574.3→105.1，己酮可可碱278.3→180.1；干燥气（N2）流速：11.0 L/min；Nebulizer：0.103 35 Mpa；干燥气温度：300 ℃；检测器电压：4 000 V。

4）血浆样品处理方法

取大鼠血浆50 μL，加入200 μL 己酮可可碱溶液（20.0 ng / mL）涡旋1 min，于4 ℃、15 000 r / min 离心10 min，取上清液置离心管中，氮吹仪下氮气吹干，残留物用50 μL 甲醇-水（50 ∶50，V / V）溶解，于4 ℃、15 000 r / min 离心10 min，取上清液置进样瓶中，取1 μL 进样。

1.2.2 药代动力学试验

乌头汤组和改良乌头汤组SD 大鼠（各6 只）自由饮水，给药前禁食12 h，灌胃给予提取液（给药体积为20 mL/kg）。分别于给药后0.083，0.25，0.5，1，1.5，2，4，6，8，12，24 h 时眼底静脉丛毛细管取血约每只0.1 mL，肝素钠抗凝，4 500 r/min 离心10 min，分离上层血浆，-40 ℃保存，备用。

1.2.3 大鼠足肿胀药效学试验

药物配制：依据给药体积为20 mL/kg，处方b、处方e 临用前以0.3% CMC -Na 配制成不同质量浓度的混悬液，吲哚美辛以0.3% CMC - Na 配制成0.625 mg/mL 的混悬液，搅拌，超声振荡，混匀，给药过程中不断混匀。

大鼠足肿胀模型建立：取清洁级雄性SD 大鼠，试验前于试验环境适应性喂养7 d 后单次口服给药，3 h 后足跖内注射1%λ-角叉菜胶溶液。分别在致炎前（0 h）及致炎后1，2，3，4 h 时采用足趾测量仪测致炎足容积，计算足肿胀百分率。

肿胀度=致炎后足容积-致炎前足容积

肿胀率（%）= [（致炎后足容积-致炎前足容积）/致炎前足容积] ×100%

1.2.4 小鼠醋酸扭体镇痛药效学试验

药物配制：依据给药体积为20 mL/kg，处方b 临用前以0.3% CMC-Na 配制成1.60，0.80，0.40 g/mL 的混悬液，处方e 临用前以0.3% CMC-Na 配制成1.28，0.64，0.32 g/mL 的混悬液，罗通定片（山西三裕制药有限公司，国药准字H14022278，规格为每片30 mg）研碎后以0.3% CMC-Na 配制成4.5 g/L 的混悬液，搅拌，超声振荡，混匀，给药过程中不断混匀。

小鼠醋酸扭体模型建立：处方b、处方e 单次灌胃给药后3 h，罗通定混悬液单次灌胃给药后0.5 h，空白对照组给予等体积0.3% CMC-Na，每只小鼠腹腔注射0.8%冰醋酸0.1 mL/10 g。由于刺激腹膜可引起扭体反应，表现为腹部收缩、躯体扭曲、后肢伸展及蠕动等。观察并记录注射致痛剂后20 min 内各小鼠的扭体次数。

图1 超高效液相提取色谱图

2 结果

2.1 方法学考察

专属性考察：取大鼠空白血浆、空白血浆+内标溶液+对照品、血浆样品，按1.2.1 项下血浆样品处理方法处理，依法进样。结果血浆的内源性物质不干扰各成分和内标的测定，表明液质行为及专属性良好。色谱图见图1。

线性关系考察：取大鼠空白血浆，每份45 μL，加入混合对照品溶液5 μL，涡旋30 s，精密吸取各标准曲线血浆样品50 μL，依法处理，按拟订条件进样测定，记录色谱图。采用加权（1/X2）最小二乘法，以待测成分峰面积与内标峰面积的比值（Y）对样品质量浓度（X）进行曲线拟合回归，得回归方程，定量限以信噪比（S/N）≥10计。结果见表1。

表1 线性关系考察结果

准确度和精密度试验：配制低、中、高3 个质量浓度的对照品血浆样品，依法处理，每个质量浓度取6 份样品，1 d 内分别测定6 份样品，并各取1 份样品连续测定3 d，计算日内、日间精密度。结果见表2，表明方法准确度好，仪器精密度好。

表2 在血浆中化合物回收率、基质效应及日内与日间精密度试验结果（n=6）

回收率试验与基质效应测定：分别制备低、中、高质量浓度的含药质控样品，依法进样分析，记录峰面积，每个质量浓度平行测定6 份，记录待测物和内标的峰面积比值（A）；另取空白血浆，依法加入对应的低、中、高浓度的系列对照品溶液进样分析，记录待测物和内标的峰面积比值（B），每个质量浓度平行测定6 份，提取回收率（% ） =A/B×100%。另用流动相将标准系列溶液配制成与上述理论浓度相同的低、中、高质量浓度溶液直接进样分析，每个质量浓度平行测定6 份，记录待测物和内标的峰面积比值（C），基质效应（% ） = B/C×100%。低、中、高质量浓度的回收率和基质效应见表2。结果表明，所建方法能满足生物样品的测定要求。

稳定性试验：取各成分低、中、高3 个质量浓度的质控样品室温放置、自动进样器内、-40 ℃长期冷冻、冷冻-解冻3 个循环等不同存储条件下的稳定性。结果见表3。表明，血浆样品室温放置4 h、血浆样品处理后在自动进样器内放置24 h、血浆样品冷冻-解冻循环3 次、血浆样品长期冷冻于-40 ℃冰箱内30 d，各成分的RSD均小于15%。

2.2 药代动力学试验

乌头碱类化合物在大鼠体内的平均药-时曲线见图2。血药浓度数据采用PKSolver V 2.0 软件计算，以药物半衰期（t1/2）、达峰浓度（Cmax）、达峰时间（tmax）和药-时曲线下面积（AUC）等参数表征该药物的药代动力学特征（各时间点血浆中均能检测到，具有完整的体内过程），运用SPSS 17.0 统计学软件分析。结果见表4。乌头汤配伍黑豆、防风后，苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱的Cmax，AUC0-t，AUC0-∞均显著下降。

表3 化合物在大鼠血浆的稳定性试验结果（n=6）

2.3 大鼠足肿胀药效学评价

处方b 和处方e 不同浓度对角叉菜胶诱导大鼠足肿胀的影响以足肿胀率进行评价。结果见图3。给药后，与模型组相比，吲哚美辛具有明显的抑制足肿胀作用。同时，处方b、处方e 也能剂量依赖性地抑制角叉菜胶诱导大鼠的足肿胀，其中处方b 高、中、低3 个质量浓度水平的效果都优于处方e。

2.4 小鼠醋酸扭体镇痛效果评价

处方b 和处方e 不同质量浓度对醋酸诱导小鼠腹部疼痛的影响，以一定时间内小鼠扭体次数进行评价。结果见图4。处方b 和处方e 都对醋酸诱导小鼠的扭体次数有一定的抑制作用，其中处方b 高、中、低3 个质量浓度水平的扭体次数较处方e 的更低，抑制效果明显，且相对稳定。

图2 灌胃处方后3 种单酯型乌头碱的药-时曲线图

表4 大鼠灌胃提取液后乌头碱类化合物的药代动力学参数（± s，n=6）

表4 大鼠灌胃提取液后乌头碱类化合物的药代动力学参数（± s，n=6）

注：与乌头汤比较，*P ＜0.05。MRT 为平均驻留时间。

化合物A B C处方乌头汤改良乌头汤乌头汤改良乌头汤乌头汤改良乌头汤t1 /2（min）654±39 634±28 416±24 439±16 459±42 461±26 Cmax（ng/mL）40.8±12.4 30.2±8.04*21.6±3.5 20.2±2.1 32.5±10.8 23.8±5.63*Tmax（min）30（30，45）30（30，45）30（30，45）30（30，45）30（30，45）30（30，45）AUC0 -t[ng/ （h·mL）]5 016±453 3 653±146*3 126±246 2 916±198 3 045±146 2 039±117*AUC0 -∞[ng/ （h·mL）]6 054±503 4 716±294*3 894±164 3 593±108 4 015±126 3 025±116*MRT0 -t（min）572±15 554±12 314±26 325±19 367±28 385±27

图3 处方b 和处方e 不同质量浓度对角叉菜胶诱导大鼠足肿胀的影响

图4 不同质量浓度处方b 和处方e 对小鼠醋酸扭体镇痛效果的影响

3 讨论

高灵敏度的UPLC-MS/MS 检测手段逐渐应用到中药复杂成分的分析及血浆中化学成分的研究[9-11]。本研究结果显示，本方法准确度、精密度、灵敏度和专属性较高，符合生物样品分析方法要求。己酮可可碱性质稳定，易溶于甲醇，在正电离模式下响应良好，不干扰其他内源性成分的测定，可满足测试需要。

处方b 血浆中发现，黑豆、防风的配伍抑制了苯甲酰新乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱的吸收，Cmax值和AUC0-t值明显下降。制川乌配伍防风、黑豆均可明显降低制川乌中的单酯型乌头生物碱在体内的含量，说明配伍防风、黑豆可有效地降低乌头汤的毒性。乌头碱型二萜生物碱既是川乌的活性成分，也是其毒性成分[12-13]，治疗量与中毒量非常接近，极易发生中毒事件，配伍防风、黑豆后降低了乌头碱型二萜生物碱在体内的浓度，达到了减毒的效果。

角叉菜胶致大鼠足肿胀模型常用于评价或筛选药物抗炎作用的经典急性炎症模型，在新药评价中应用非常广泛。本研究中通过药物作用于角叉菜胶致大鼠足肿胀模型后，发现处方b、处方e 对角叉菜胶引起的足肿胀均有明显的抗炎作用[14-15]。小鼠醋酸扭体模型是通过于小鼠的腹膜内腔内注射乙酸诱导急性炎症疼痛，其特征在于经后肢牵张腹部肌肉系统的收缩波，称之为扭体反应，扭体发作次数的多少可反映动物对乙酸引起疼痛的反应强弱[16-17]。本研究结果显示，处方b、处方e 对乙酸刺激小鼠诱导的疼痛反应有明显的抑制作用，处方b 的镇痛作用优于处方e。

综上所述，处方b（即改良乌头汤）达到了减毒增效的效果，有利于关节炎的治疗。该结论可为下一步开展乌头汤减毒增效配伍的机制研究提供了参考。