吞咽障碍动物模型研究进展

李斯锦，李彦杰，秦合伟，金小琴，牛丽

1.河南中医药大学，河南郑州市 450046；2.河南省中医院，河南郑州市 450002

吞咽障碍是由于下颌、舌、软腭、咽喉、食管括约肌或食管功能受损，导致进食困难，不能安全有效地把食物由口送到胃内，以取得足够营养和水分[1]。吞咽困难是临床常见症状，可发生于任何年龄，脑卒中、肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)、帕金森病、口咽部神经肌肉病变如喉上神经损伤等多种疾病均可引起吞咽障碍。吞咽障碍往往伴有误吸、肺炎、营养不良、心理和社会交往障碍等严重并发症，严重影响患者生活质量，增加病死率。吞咽障碍的临床研究日益受到学者重视，吞咽障碍患者的管理，如诊断、评估、治疗与康复等，国内专家也达成共识[2-3]。

利用动物模型进行基础研究，是研究吞咽障碍相关疾病病理机制及其治疗机理的重要手段。经过不断研究，已开发出多种吞咽障碍动物模型，表现与人类相似的摄食吞咽功能障碍等行为学变化。

1 实验动物

目前用于吞咽障碍研究的动物主要有啮齿类动物、非人灵长类动物和其他哺乳动物。根据实验要求选择合适的实验动物非常重要。

1.1 啮齿类动物

啮齿类动物是各种疾病模型的经典实验动物，也常用于吞咽障碍造模。Wistar 大鼠较为温顺，被用于复制脑卒中后吞咽障碍[4]和口咽部神经损伤[5]等模型。Sprague-Dawley 大鼠从Wistar 大鼠培育而成，生长发育快，适应性和对传染病的抵抗力较强，也被选作帕金森病、脑卒中等[6]吞咽障碍动物模型。小鼠体小、易于控制，也是吞咽障碍造模的重要动物[7-8]。大、小鼠模型稳定，容易获取，易于饲养繁殖和基因改造，寿命较短，价格较低，是吞咽障碍研究最常用的实验动物。

1.2 非人灵长类动物

非人类灵长类动物与人类的行为、生理学特征较为相似。有研究使用猕猴作为实验动物[9]，发现猕猴吞咽的颚骨周期较短，舌骨和甲状腺向上运动，与人类相似，可以作为吞咽障碍研究的实验模型。也有研究通过在环尾狐猴等猴类动物舌头或咬肌等处植入微电极[10-13]，记录吞咽运动时肌肉募集和感觉运动等，模拟人类吞咽行为。

1.3 其他哺乳动物

一些哺乳动物，如猪、犬、猫、兔等，也成为吞咽障碍研究模型。雌性幼猪常用于研究单侧喉上神经损伤[14]或喉返神经损伤[15-17]，以及腭部麻醉导致腭感觉减退[18]等引起的吞咽障碍。纤维鼻咽喉镜吞钡功能检查(fiberoptic endoscopic examination of swallowing,FEES)用于有吞咽障碍狗的吞咽功能检查[19]，具有一定可行性；损伤狗的喉返神经也可引起吞咽障碍[20]。家兔、猫等也被用来模拟人类吞咽障碍，行浅部或深部电极植入等，可观察吞咽运动的机制[21-24]。这些新的哺乳动物模型值得进一步研究。

2 模型制备

根据导致吞咽障碍的病因，已构建多种疾病吞咽障碍模型。比较常见的疾病模型如下。

2.1 脑卒中

脑卒中是引起吞咽障碍最常见的原因之一，脑卒中后，50%以上患者会出现吞咽困难[25]。其中最常见的是缺血性脑卒中，包括大脑中动脉在内的大脑区域局部缺血会导致吞咽困难。用线栓法诱导大鼠大脑中动脉缺血已被广泛应用。近年来，线栓法短暂性阻塞大鼠单侧大脑中动脉(transient middle cerebral artery occlusion,tMCAO)作为一种卒中后吞咽障碍模型得到验证[4,26]。线栓法阻塞大鼠大脑中动脉90 min 后再灌注，第14 天时可引起吞咽次数减少和吞咽延迟反应时间增加等症状，大鼠同侧大脑皮质和皮质下组织等有典型的缺血病变，而由其他脑动脉供血的脑干和小脑等脑区没有局部缺血；在咽反射启动中起主要作用的喉上神经和舌咽神经咽分支，术后未受到损害；吞咽障碍主要由于大脑中动脉闭塞后，皮质或皮质下功能障碍所致。尽管病变部位对吞咽的影响尚无共识，但与人类缺血性脑卒中患者吞咽功能受损引起的咽部吞咽障碍是一致的。Gulyaeva 等[27]发现，tMCAO 大鼠除吞咽启动延迟和吞咽次数减少外，还伴有伸舌减少和舌力减弱等特征。但tMCAO大鼠在造模术后2～3 周才出现吞咽功能受损，与人类卒中后头几天就能观察到吞咽困难不一致，可能与大鼠缺血后脑细胞死亡缓慢有关，有待研究。此外，双侧颈总动脉闭塞诱导慢性脑低灌注6 周模型[28]和颈总动脉结扎模型[29]等，作为脑卒中后吞咽障碍模型也正在开发与验证。

2.2 ALS

SOD1-G93a转基因小鼠是ALS口腔期吞咽障碍[30]和咽期吞咽障碍[31]的有效模型。其中口腔期吞咽障碍表现为舔吮和咀嚼率下降，脑干三叉神经和舌下神经核液泡样变性；咽期吞咽障碍表现为需要更高频率电刺激刺激喉上神经，以诱发吞咽动作，脑干疑核和孤束核液泡样变性。

Osman 等[32]比较低拷贝数(low copy number,LCN)和高拷贝数(high copy number,HCN)转基因超氧化物歧化酶1 (superoxide dismutase 1,SOD1)小鼠ALS 模型的吞咽困难表现，透视荧光吞咽检查(videofluoroscopic swallowing study,VFSS)和组织形态学研究发现，与对照组相比，HCN-SOD1和LCN-SOD1小鼠舔速率、吞咽速率、吞咽间期和咽转运时间均有明显变化；而与同龄对照组相比，LCN-SOD1小鼠舌质量、舌背表面积、总舌长和尾舌长度降低，与人类ALS患者的吞咽困难、舌萎缩和舌下神经核病变类似，对ALS吞咽障碍研究更有复制价值。

2.3 帕金森病

帕金森病是临床常见的神经退行性病变之一，已有多种帕金森病吞咽障碍动物模型。将神经毒素6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)注入大鼠单侧前脑内侧束诱导黑质纹状体多巴胺耗竭[33-35]，以及PINK1基因敲除大鼠模型[36]，这些模型均有舌感觉和运动功能减弱等吞咽障碍表现，可作为帕金森病吞咽障碍模型。

2.4 口咽部神经肌肉病变

口咽部神经肌肉损伤或感觉障碍等也可导致吞咽困难。目前外周神经肌肉损伤导致吞咽障碍的模型主要有单侧舌下神经切断小鼠模型[37]、喉返神经损伤[38-39]或喉上神经损伤[14]等动物模型，以及通过咽腭部局部麻醉使腭感觉减退的幼猪吞咽障碍模型[18]。这些损伤在动物中相对比较容易复制。

3 吞咽功能的评价和监测

吞咽功能评定主要测量实验动物的吞咽次数、吞咽延迟反应、误吸、舌肌活动、喉部运动等方面的表现，是判断造模成功与否的重要标准。

3.1 VFSS

VFSS 是人类吞咽障碍检查的金标准，能识别没有临床症状的隐形误吸，但也有辐射危险[40]，且有运动或其他功能障碍的患者往往无法配合完成。在动物模型中使用VFSS 具有不受辐射和肢体功能限制等优点，同时可以植入无线电不透明标记等，对吞咽运动进行详细的运动学分析。Best 等[10]用皮下针将3 个直径0.5 mm 的钽球植入雌性恒河猴的舌前、中、后区域，对C 臂荧光镜进行改造，以100 帧/s 速率获得猴颌骨和舌运动的二维侧视视频，采用半自动标记跟踪算法，提示VFSS 经改进，可以应用于研究各种吞咽障碍模型的吞咽参数。Lever等[41]开发了小鼠VFSS 协议，用于测试脑卒中、帕金森病、ALS等疾病引起的吞咽障碍，包括定制设计一个使小鼠可以自由活动的观察室，调制出能掩盖造影剂难闻气味以保证小鼠摄取充分密度的含造影剂食物，以及分步测试以最大程度提高动物依从性，从而保证小鼠VFSS 顺利进行。与人类相比，鼠VFSS可以较高速率成像(100～500帧/s)，能量化多种吞咽参数。

3.2 肌电图

临床上检测吞咽障碍患者大多应用无创的表面肌电图，很少使用侵入性针极肌电图，所以只能评估表浅肌肉的功能，而无法评估对吞咽至关重要的舌肌、舌骨下肌群和舌骨上肌群[42]。动物模型可以通过插入针极电极或植入电极，测量深部吞咽相关肌肉在静息和吞咽运动时的生物电信号，评估吞咽功能。Vinyard 等[11]将双极留置电极插入环尾狐猴的咬肌中，记录清醒状态下咀嚼食物时的肌肉募集活动，通过比较峰值时间研究咬肌在咀嚼周期中的募集和活动模式。Lang等[43]将电极置于猫的咽、喉和食道，证实食管酸化对食管上括约肌松弛和收缩等食管反射的影响。DeLozier 等[44]将电极植入喉返神经损伤幼猪的舌肌、舌骨上肌群和舌骨下肌群，记录肌肉运动与口腔期食团活动的相关性，证实喉返神经损伤对幼猪口咽肌活动和感觉运动整合的影响。Tsujimura等[45]将电极插入双侧舌下神经和喉返神经损伤大鼠的舌骨上肌群和舌肌，分析刺激喉部诱发的吞咽肌电信号变化等，观察舌下神经和喉返神经对吞咽功能的影响，具有可行性。

3.3 神经电刺激与肌电图联合评估

电刺激特定的神经，如喉上神经、喉返神经等，被广泛用于诱发动物模型的吞咽反射，常与肌电图联合应用，研究吞咽功能的神经调控。Tsuji等[46]电刺激喉上神经、喉返神经和皮质吞咽区，诱发吞咽动作，肌电图记录左下颌舌骨肌电活动，结果表明，持续刺激诱发的吞咽频率逐渐减少，以持续刺激喉上神经最为明显，可能提示自主吞咽在起始反应上有显著差异。Satoh 等[47]通过重复电刺激喉上神经诱导麻醉大鼠吞咽反射，记录下颌舌骨肌电活动，提示红核参与吞咽的控制。Tsujimura等[48]重复电刺激皮质咀嚼区a 区和p 区以及喉上神经诱发吞咽反射，记录咬肌等肌肉的电活动，表明皮质咀嚼区a 区激活吞咽反射，而不是p区。

3.4 其他

其他评估与检测方法有舌压力测量、FEES、张力传感系统检测、神经功能学评估、目测喉部运动等；此外还可监测模型动物的体质量和进食水量等变化，以及动物的精神状态变化等。上述检测方法可以联合运用。

Ciucci 等[33]利用特定装置测量大鼠舌力和时间参数，检测6-OHDA 单侧前脑内侧束注射帕金森病吞咽障碍大鼠模型的舌功能，给药后，大鼠最大舌力和平均舌力降低，舌平均按压时间延长，出现舌功能减退等吞咽困难症状。Marks 等[19]对成年狗行FEES，能观察到鼻咽、口咽和食管的运动，以及食团在食道和胃中的推动等，是一种可行的诊断工具，但吞咽困难动物是否都能耐受还有待研究。袁清洁等[26]利用张力传感系统观测tMCAO 大鼠50 s内由蒸馏水引发的吞咽潜伏期和吞咽次数，观察大鼠体质量及进食水量变化，并进行神经功能评估等，发现通咽喷雾剂可有效改善大鼠的吞咽功能，在改善进食水方面有较好效果。

4 小结

目前用于研究吞咽障碍的动物种类和方法越来越多，每种疾病模型都有各自的造模方法和评估检测指标，麻醉剂的选择和剂量也不统一，需要研究者基于研究目的和方向进行选择。理想的吞咽障碍模型应具有临床相似性、可操作性、可重复性和可调控性，迄今尚无任何动物模型可以完美复制人类吞咽障碍的表型。随着定向遗传基因修饰等技术的发展，不同检测指标的联合使用，人们对于吞咽障碍机制的认识也将更为深刻；利用吞咽障碍模型探索吞咽障碍的病理生理及吞咽动力学等，将为吞咽障碍的药物治疗研究以及新治疗靶点的发现提供更多可能。目前许多治疗吞咽障碍的中医药疗法有待验证，应用吞咽障碍动物疾病模型，挖掘中医药治疗吞咽障碍的新疗法有广阔前景。

利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突。