欧帅,赵峰,邹朝阳,刘萌,王志,牟伟丽,苏志卫,周德庆*
1(上海海洋大学 食品学院,上海,201306) 2(中国水产科学研究院黄海水产研究所,青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋药物与生物制品功能实验室,山东 青岛,266071)3(蓬莱汇洋食品有限公司,山东 蓬莱,265600)4(青岛益和兴食品有限公司,山东 青岛, 266000)
大菱鲆英文名字为turbot,音译为“多宝鱼”,其含肉率高,肉质鲜美,富含胶原蛋白、多不饱和脂肪酸和多种人体必需的微量元素,深受消费者喜爱[1-3]。目前,大菱鲆主要以鲜活销售和冰鲜销售为主,且在捕捞、储存和运输过程中易受微生物污染,极易腐败变质[4-5]。国内外对大菱鲆品质保鲜的研究主要是针对冷藏保鲜[6]和冰鲜[7]的研究,但冷藏和冰鲜只适于水产品的短期保鲜[8-9],极大制约了大菱鲆的生产加工水平。冻藏是水产品保鲜应用最广泛的方式之一。研究表明,冻藏可抑制微生物的繁殖,抑制酶的活性,减缓脂肪氧化、蛋白变性,可使鱼肉的保鲜期长达数月乃至一年以上[10-11]。因此,研究不同冻结方式处理的大菱鲆鱼片在冻藏过程中品质的变化具有重要的现实意义。
本实验以鲜活大菱鲆为研究对象,经5种不同冻结方式(-20 ℃冰箱冻结、-20 ℃平板冻结、-30 ℃冰箱冻结、-30 ℃平板冻结、-90 ℃液氮冻结)处理后置于-18 ℃冻藏15周,根据冻藏过程的理化指标(持水力、pH、白度值、TBA值、肌原纤维蛋白含量、活性巯基含量、Ca2+-ATPase活性)、质构特性(硬度、弹性、胶黏性、咀嚼性)和微观结构3个方面进行综合评价,研究不同冻结方式处理下大菱鲆鱼片的品质变化规律,探究最适于保持大菱鲆鱼片品质的冻结方式,以期为大菱鲆的冻藏保鲜提供理论参考和技术支持。
鲜活大菱鲆,购于青岛市西海岸新区水产批发市场,每条净重750~1 000 g。HCl、KCl、硼酸、H2SO4、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、三氯乙酸、乙醇、溴甲酚绿、甲基红、1,1,3,3-四乙氧基丙烷、组织固定液均为国产分析纯,上海国药集团化学试剂有限公司;5,5′-二硫代双(2-硝基)苯甲酸(DTNB),美国Sigma公司;ATP酶试剂盒,南京建成生物工程研究所。
卧式平板速冻机(TPF720F),烟台中孚冷链设备有限公司;柜式液氮速冻机(DJL-QF50A),深圳德捷力冷冻科技有限公司;医用低温保存箱(DW-86L388A)、医用低温保存箱(DW-40L348),海尔集团;匀浆机(T18),广州艾卡设备;数显恒温水浴锅(HH-6),常州国华电器有限公司;光栅分光测试仪(YS3010),深圳市三恩时科技有限公司; pH计(FE20),上海梅特勒-托利多科学仪器有限公司;高速冷冻离心机(Ncofuge 15R),上海力申科学仪器有限公司;单光束紫外/可见分光光度计(UV1102Ⅱ),上海天美科学仪器有限公司。
1.3.1 材料预处理
鲜活大菱鲆经去尾、断鳃,流水冲洗10 min至鱼血放干,沥干水分后剖片、去皮、整形、控水、鱼片备用。
1.3.2 冻藏与解冻
冻藏:将预处理后的大菱鲆鱼片随机分成5组,各组分别记为A组、B组、C组、D组、E组,用保鲜袋分装后真空包装,分别置于-20 ℃冰箱、-20 ℃平板速冻机、-30 ℃冰箱、-30 ℃平板速冻机、-90 ℃液氮速冻机中进行冻结,待鱼肉中心温度达到-18 ℃后于-18 ℃冷库冻藏。
解冻:对冻藏样品进行定期取样,所取样品带包装于静止自来水(20±2)℃中解冻3 h,解冻后样品用于各项理化指标的测定。
1.3.3 冻结速率曲线绘制
每组样品随机选取3个样品,将灭菌后的温度记忆芯片置于大菱鲆鱼片的中心位置,每隔1 min记录1次温度。待冻结结束后取出,读取数据,绘制温度变化曲线图。
1.3.4 指标测定
1.3.4.1 持水力的测定
解冻损失率:参考刘欢等[12]的方法。将冻结的大菱鲆鱼片称取质量(m1)后,于静止自来水(20±5)℃中解冻3 h,用厨纸吸干鱼片表面水分,称取质量(m2),各组鱼片的解冻损失率按公式(1)计算:
(1)
蒸煮损失率:参考KlLlÇG等[13]的方法。取解冻后样品10 g左右(m1),用厨纸吸干表面的水分后放入保鲜袋中,于85℃恒温水浴25 min,冷却至室温,用厨纸吸干表面的水分,称取质量m2。蒸煮损失率计算如公式(2):
(2)
1.3.4.2 pH值测定
参考GB5009.237—2016 《食品安全国家标准食品pH值的测定》方法进行检测。
1.3.4.3 白度的测定
参考胡亚芹等[14]的方法采用分光测色仪的SCI测量模式,测定大菱鲆鱼片的L*(亮度)、a*(红度)、b*(黄度)后计算白度。
白度(W)计算如公式(3):
(3)
1.3.4.4 硫代巴比妥酸(TBA)值的测定
参考KHAN等[15]的方法,略做改动。取2.00 g绞碎的鱼肉于50 mL离心管中,依次加入10 % 三氯乙酸8 mL、蒸馏水8 mL,混匀,4 000 r/min匀浆×每匀浆30 s烃30 s重复4次,再4 000 r/min离心5 min,双层滤纸过滤。取4 mL滤液于试管中,加入1 mL 0.01 mol/L的TBA,混匀,沸水浴40 min,取出冷却至室温,于532 nm处测定吸光度。
1.3.4.5 肌原纤维蛋白含量的测定
参考仪淑敏等[16]和KONNO等[17]的方法,略加修改。准确称取3.00 g鱼肉,加入15 mL 0.1 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.2),匀浆8 000 r/min每匀浆30 s烃30 s重复4次,4 ℃条件下转速10 000 r/min,离心20 min,弃上清液。以上步骤重复3次。在沉淀物中加入15 mL 0.5 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.0),4 ℃浸提1 h,离心取上清液,即为肌原纤维蛋白溶液,通过双缩脲法测定其含量。
1.3.4.6 活性巯基含量的测定
参考ZHOU等[18]的方法并略加修改。取上述肌原纤维蛋白溶液0.5 mL,加入4.5 mL 0.2 mmol/LTris-HCl(内含10 mmol/L EDTA,2 % SDS,pH 6.8),混合均匀。再加入0.5 mL溶液浓度为1 g/L的5,5′-二硫代双(2-硝基)苯甲酸溶液(0.2 mol/L Tris-HC1,pH 6.8),混匀后40 ℃水浴25 min,于波长412 nm处测定吸光度。
1.3.4.7 Ca2+-ATPase活性测定
参考南京建成生物研究所ATP酶测试说明书的测定方式。
1.3.4.8 质构特性测定
质构仪TPA模式参考宋敏等[19]的方法并略加修改。设定参数为:将鱼片切成3 cm×3 cm×1 cm大小采用P50 探头,形变量50%、感应力5 g、测前速率5 mm/s、测试速率1 mm/s、测后速率5 mm/s、两次压缩时间间隔5 s。重复3次,取平均值。
1.3.4.9 微观组织观察
参考李思宁等[20]的方法并略加修改。微观组织图像采集步骤如下:
鱼片切成5 mm×5 mm×3 mm大小→组织固定液固定24 h以上→依次梯度酒精脱水→石蜡包埋→切片机切3 μm厚切片→60 ℃烘箱内烤片→苏木素染色→伊红染色→脱水封片→显微镜检验,图像采集
1.3.5 数据分析
实验数据采用SPSS 22.0软件进行分析处理,利用Origin 2018进行作图。
图1反映的是大菱鲆鱼片在5种冻结方式下从20 ℃到-18 ℃的温度变化曲线。由图可知,不同冻结方式的变化曲线具有显著的差异,其中-90 ℃液氮速冻使通过最大冰晶生成带(-1℃~-5 ℃)的时间为8 min,中心温度达到-18 ℃所需要的时间为31 min,通过最大冰晶生成带的时间和冻结时间明显短于其他4个冻结组,说明-90 ℃液氮速冻冻结速率最快,可大大缩短大菱鲆鱼片的冻结时间。在-20 ℃条件下,冰箱冻结组大菱鲆鱼片通过最大冰晶生成带的时间为398 min,是平板速冻组的11.94倍,冻结时间为639 min,延长了6.07倍;-30 ℃条件下,冰箱冻结组大菱鲆鱼片通过最大冰晶生成带的时间为215 min,是平板速冻组的11.71倍,冻结时间为297 min,延长了3.62倍,且-20 ℃平板相比于-30℃冰箱也具有相对优势(P<0.01)。说明平板速冻相比于冰箱冻结也具有更快的冻结速率。这是因为平板速冻的鱼片直接与上下导热板接触,从而极大提升了大菱鲆鱼片的冻结速率。
研究表明,样品通过最大冰晶带的时间越短,冻结速率越快,冰晶生成越细小,越有利于保存样品品质,延长货架期。可见,相比于冰箱冻结,采用液氮速冻与平板速冻更有助于提高大菱鲆鱼片的冻结效率,提升其冷冻品质。
图1 不同冻结方式下大菱鲆鱼片的冻结曲线Fig.1 Freezing curve of turbot fillets under different freezing methods
持水力是肌肉组织通过物理方式截留大量水而阻止水渗出的能力,持水力越大,肌肉组织损伤越小[21]。解冻损失率和蒸煮损失率是描述冻结食品持水性的重要指标,与持水力呈负相关关系。食品在冻结过程中,食品中的大部分水形成冰晶,食品组织受到损伤,解冻过程使食品内部冰晶融化,组织收缩,汁液不可逆流失,持水力下降[22-23]。
由图2可知,经不同冷冻方式处理后,大菱鲆鱼片的解冻损失率均随着时间变化不断升高。冻藏15周后,A~E组的大菱鲆鱼片解冻损失率分别为6.51%、5.8%、6.01%、4.99%、4.53 %,与冻藏1周相比,分别上升了112.05%、103.51%、105.12%、98.02%、96.10%,且差异显著(P<0.05),且A组处理后的大菱鲆鱼片解冻损失率始终显著高于其他样品组,这是因为-20 ℃冰箱冻结导热差、鱼片通过最大冰晶生成带时间长,生成的冰晶大,对组织结构破坏大所致[14]。在图3中,各实验组在冻藏期间蒸煮损失率明显高于新鲜样品,并随着冻藏时间延长而升高。在整个冻藏期间内,E组样品的蒸煮损失率明显低于其他4种处理方式,且平板速冻组优于冰箱冻结组,说明冻结温度越低,冻结速率越快,越有利于大菱鲆鱼片的持水力保持。
A~E组分别对应-20℃冰箱、-20℃平板速冻机、-30℃冰箱、-30℃平板速冻机、-90℃液氮速冻机处理。下同。图2 解冻损失率在冻藏期间的变化Fig.2 Changes in thawing loss rate during frozen storage
图3 蒸煮损失率在冻藏期间的变化Fig.3 Changes in cooking loss rate during frozen storage
由图4可知,随着冻藏时间的延长,鱼片的pH呈现先下降后上升的趋势,且不同冻结方式处理后的鱼片差异显著。从鱼体死亡到冻藏中后期,鱼片pH持续降低。其中,A组后的鱼片pH在第9周达到最低,为6.18;B组和C组后的鱼片pH在第11周达到最低,分别为6.21、6.18;D组和E组在第13周达到最低,分别为6.21、6.16,由于鱼体死亡后机体内肌糖原由于缺氧分解形成乳酸等酸性物质,使pH下降,鱼片冻结速率越快,pH下降越慢。在冻藏中后期,鱼片中的各种酶及微生物使鱼肉中的蛋白质、含氮化合物缓慢分解为碱性含氮物,使鱼片pH呈现上升趋势,且E组的pH上升最为缓慢,其次是D组、B组、C组,这和彭欢欢等[24]的研究结果具有相似性。范碧琴等[25]认为低温更能抑制酶的活性,减缓微生物的繁殖,而在前期的研究中发现,-90 ℃液氮速冻的冻结速度最快,更有利于抑制鱼肉组织内酶的活性和微生物的生长,从而减缓了机体内糖原分解、蛋白降解等导致的pH变化。因此,在鱼片冻结过程中,可通过提高冻结速率、降低冻结温度来抑制微生物和酶的活性,从而缓解鱼片pH的剧烈变化。
图4 pH在冻藏期间的变化Fig.4 pH changes during frozen storage
白度值反映了鱼片的色泽变化,不同冻结方式处理后的大菱鲆鱼片白度值如图5所示。随着冻藏时间的延长,各实验组的白度值均呈现上升趋势,这和徐永霞等[26]研究冷藏鲈鱼品质的变化时所得结果一致,其中,A组的白度值上升速度最快,显著高于其他4个样品组的白度值,且冻藏温度越低及冻结速率越快,白度值变化越缓慢,这是因为鱼片在冻结过程中生成冰晶,组织内部遭受压力,蛋白变性,形成不透明的凝胶体,使白度上升[26]。
在冻藏过程中,鱼类脂肪水解产生的游离脂肪酸氧化分解为丙二醛(MAD),其能与TBA反应生成红色络合物,TBA值越高,脂肪氧化程度就越高[27]。
由图6可知,新鲜鱼片的初始TBA值为0.04 mg/kg,随着冻藏时间的延长,各实验组的TBA值均呈现上升趋势,冻藏15周后,A~E组的TBA值分别为0.45、0.39、0.41、0.38、0.33 mg/kg。冻藏前3周,各实验组TBA值上升速度最快,之后则呈现缓慢增加,这是因为流失汁液浸出的游离脂肪酸和鱼片体表脂肪率先氧化,组织内脂肪缓慢氧化造成的。其中,A组的TBA值上升速度最迅速,而E组的TBA值上升速度最为平缓,这是因为-20 ℃冰箱冻结相比-90 ℃液氮速冻通过最大冰晶生成带的时间长,鱼片内部形成的冰晶大,对组织破坏程度增加,组织内脂肪酸的溶出增加,且包装内残余氧深入组织内部,进一步加速了脂肪氧化。在本研究中,各组鱼片在冻藏15周时的TBA极大值为0.45 mg/kg,远低于李婷婷等[28]研究微冻储藏大菱鲆脂肪氧化时的极大值(2.3 mg/kg),显示冷冻保存能显著抑制大菱鲆的脂肪氧化。
图5 白度值在冻藏期间的变化Fig.5 Changes in whiteness value during frozen storage
图6 TBA值在冻藏期间的变化Fig.6 Changes in TBA value during frozen storage
鱼肉中肌原纤维蛋白占鱼体总蛋白的60%~70%,是鱼肉中最重要的结构蛋白和功能性蛋白,其含量可反映蛋白的变性程度。由图7可知,各组在整个冻藏过程肌原纤维蛋白均呈现下降趋势,冻藏15周后,A~E组大菱鲆鱼片的肌原纤维蛋白含量分别为14.30、15.95、14.79、16.73、17.39 g/L,相比新鲜样分别下降了46.72%、40.57%、44.90%、37.67%、37.26%。其中A组下降最快,E组下降最慢,且平板冻结组明显优于冰箱冻结组(P<0.05)。其他研究表明,冷冻使蛋白质结构受到破坏,促使二硫键、疏水键和氢键形成,蛋白质分子间作用增强[29];同时,蛋白内部的疏水基团暴露在外,降低了肌原纤维蛋白表面的有效电荷,使蛋白质相互聚集,溶解度降低[30]。钱书意等[31]也认为冻藏温度越低,越有利于维持肌肉肌原纤维蛋白溶解度,降低蛋白聚集程度。说明-90℃液氮速冻处理有利于维持肌原纤维蛋白结构的稳定性,使大菱鲆鱼片在冻藏过程在保持良好的品质特性。此外,THANONKAEW等[32]的研究认为,冰晶引起的脂肪氧化和蛋白变性会诱导肌肉白度增加,这和上述研究结果具有一致性。
图7 肌原纤维蛋白含量在冻藏期间的变化Fig.7 Changes in myofibrillar protein content during frozen storage
活性巯基是肌原纤维蛋白活性和功能基团的重要组成成分,具有较高反应活性,对维持蛋白空间结构稳定及其理化和功能性质具有重要的作用。通过测定肌原纤维蛋白的活性巯基含量可反映肌原纤维蛋白的氧化变性程度。由图8可知,各实验组在整个冻藏过程肌原纤维蛋白的活性巯基均呈两段式下降趋势,冻藏前3周,A~E组的鱼片肌原纤维蛋白的活性巯基含量急速下降;到冻藏结束,各实验组的活性巯基含量分别为2.09×10-5、2.34×10-5、2.26×10-5、2.44×10-5、2.53×10-5mol/g,比鲜鱼片分别降低了56.18%、50.94%、52.62%、48.85%、46.96%。其中E组下降最缓慢,D组次之,A组最快,且平板冻结组相比于冰箱冻结组具有明显优势(P<0.05)。研究表明,在冻藏过程中,形成的冰晶会使肌原纤维蛋白构象发生改变,蛋白分子内部的巯基暴露出来,进而氧化生成二硫键,活性巯基减少[33]。同时,冰晶的生成使细胞间渗透压升高,组织内蛋白质分子因盐析作用或重金属作用发生变性,活性巯基含量下降,且冻结速率越慢,生成的冰晶越大,蛋白变性程度越大[34]。
图8 活性巯基含量在冻藏期间的变化Fig.8 Changes in active thiol content during frozen storage
肌原纤维蛋白的Ca2+-ATPase活性源于肌球蛋白的球状头部,可作为评价鱼类肌原纤维蛋白完整性的一个重要指标[35]。鱼片在冻藏过程中,肌原纤维蛋白中的疏水键、二硫键、和氢键等相互作用,蛋白质构象发生改变或者聚集,Ca2+-ATPase活性下降[36]。不同冷冻方式处理后菱鲆鱼片肌原纤维蛋白的Ca2+-ATPase活性变化如图9所示。
图9 Ca2+-ATPase活性在冻藏期间的变化Fig.9 Changes in Ca2+-ATPase activity during frozen storage
由图9可知,各实验组的Ca2+-ATPase活性呈现与活性巯基相同的变化趋势,冻藏15周后,A~E组鱼片肌原纤维蛋白的Ca2+-ATPase活性较鲜鱼片的酶活力0.36 μmolPi/(mg·h)分别下降了43.97%、38.28%、47.19%、27.82%、24.35%。其中E组的Ca2+-ATPase活性下降最快,D组次之,这与白妍等[37]和刘小莉等[38]的研究结果具有相似性。
研究发现,肌球蛋白头部巯基的氧化会促使肌原纤维蛋白Ca2+ATPase活性的下降[39]。在本研究中,大菱鲆鱼片的活性巯基在冻藏过程中因蛋白变性而逐渐下降,并促使Ca2+-ATPase活性逐渐下降。与冰箱冻结相比,-90 ℃液氮冻结速度快,冻结过程形成的冰晶小,对肌肉损伤少,从而减少了肌原纤维蛋白的变性程度,减少了巯基的暴露,进而减缓了Ca2+-ATPase活性的降低。
用质构仪对肉制品进行质构测定并辅以感官评价,可客观反映肉制品的食用品质[40]。经不同冻结方式处理过的大菱鲆鱼片在冻藏期间的质构变化情况如表1所示。随着冻藏时间的延长,大菱鲆鱼片的硬度、弹性、胶黏性和咀嚼性均呈现不同程度的下降。冻藏15周后,-20 ℃冰箱冻结、-20 ℃平板冻结、-30 ℃冰箱冻结、-30 ℃平板冻结、-90 ℃液氮冻结处理过的鱼片硬度分别下降了76.86%、67.55%、71.16%、66.68%、66.39%;弹性分别下降了31.22%、27.17%、29.39%、22.45%、19.72%;胶黏性分别下降了70.56%、53.37%、63.28%、58.24%、54.93%;咀嚼性分别下降了71.12%、60.05%、64.27%、59.58%、54.03%。由实验结果可知,E组各指标下降最为缓慢,D组次之,A组下降最快,表明低温速冻可以较好地保持大菱鲆鱼片的品质,这与肌原纤维蛋白含量、活性巯基含量、Ca2+-ATPase活性指标的评价结果一致。韩洋[41]在研究阿拉斯加鳕鱼在冻藏过程中的品质变化时也得出相似结论,冻结温度越低,越有利于维持鱼肉的质构特性,抑制品质劣化。
表1 质构特性在冻藏期间的变化Table 1 Changes in texture characteristics during frozen storage
注:a-e,同一参数的均值后标注不同的字母表示存在显著性差异(P<0.05),相同字母表示差异不显著(P>0.05);“-”表示未处理。
如图10-a所示,新鲜大菱鲆鱼片的切面纤维结构完整,呈致密的网状结构,清晰可见,纤维之间观察不到明显的间隙。图10-b~图10-f中,A~E组大菱鲆鱼片的微观组织结构呈现不同程度细胞间隙增大、破碎变形的现象。冻藏1周时,A组鱼片的已出现大的细胞间隙,细胞相对分散;B~D组开始出现片状间隙,细胞结构相对完整;E组间隙较少,纤维结构清晰,细胞结构完整。冻藏15周后,各实验组表现出更加显著的差异。A组鱼片的纤维碎片化程度高,细胞散乱;B、C组鱼片的纤维结构明显疏松,并出现断裂现象;D组鱼片的纤维片状间隙加剧,结构比较松散;E组开始出现片状间隙,组织结构受到一定程度的破坏。
有研究发现,肌原纤维间隙中的主要填充物为肌浆蛋白及肌基质蛋白等[42]。其中,肌浆蛋白含量高且水溶性好,随着冻结时间的延长,鱼肉组织内冰晶进一步生长,解冻后水分流失加剧,肌浆蛋白溶出增加,肌原纤维空隙增大[43]。同时,肌原纤维自身也会发生冷冻变性,促使肌原纤维蛋白降解,碎片化程度增加。冰箱冻结速度慢,冰晶较大,对组织破坏进一步加剧。而-90 ℃液氮速冻冻结速度快,鱼片内冰晶形成小,对肌肉组织破坏小,肌原纤维降解程度低。因此,低温速冻处理更有利于保持大菱鲆鱼片微观组织结构的完整。
a-新鲜样;b-A组(-20 ℃冰箱冻结);c-B组(-20 ℃平板速冻);d-C组(-30 ℃冰箱冻结);e-D组(-30 ℃平板速冻);f-E组(-90 ℃液氮速冻)图10 微观组织结构在冻藏期间的变化(10×10)Fig.10 Changes in microstructure during frozen storage注:除a外,每组图片左侧为冻藏1周时的鱼片组织,右侧为冻藏15周时的鱼片组织。
本研究通过测定5种冻结方式处理的大菱鲆鱼片在-18 ℃冷库冻藏15周内的理化指标、质构特性和微观结构,结果显示-90 ℃液氮速冻组(E组)的大菱鲆鱼片各指标明显低于或迟缓于其他4个实验组,且平板冻结组(B组、D组)相比于冰箱冻结组(A组、C组)也具有明显优势,表明冻结温度越低及冻结速率越快,越有利于减缓大菱鲆鱼片冻藏期间肉色变白,脂肪氧化,蛋白冷冻变性,硬度、咀嚼性等下降,更好地保持鱼片的品质。显示低温速冻在大菱鲆鱼片品质保鲜方面具有广阔的应用前景。