神经生长因子促进骨折愈合的研究进展

杨 冰，马天宇，马 维

河北医科大学第二医院骨科，石家庄 050000

骨折是临床上的常见病、多发病。最新的研究表明，我国每年约有440万人经历过创伤性骨折，且骨折发生率呈上升趋势[1-2]。骨折愈合一直是骨科医师关注的重点问题之一。据统计，美国骨折发生率为2704/(10万人·年)，其中约10%的骨折患者存在骨折愈合不良或骨不愈合的情况，这不仅增加了患者的经济负担和住院时间，还会造成患者长期病痛、患肢功能残缺，极大地影响患者的生活质量[3]。有研究显示神经生长因子(nerve growth factor，NGF)具有促进骨折愈合的作用，现就NGF促进骨折愈合的研究进展做一综述。

NGF结构与作用机制

NGF的结构NGF于上世纪50年代首次在小鼠体内发现[4]。NGF由α、β、γ 3个亚基构成，有生物活性的部分为βNGF。βNGF是一种二聚体，由3个半胱氨酸键连接[5- 6]，其相对分子质量为2.65×104，沉降系数为2.5 S[7]。目前认为，NGF是一种通过旁分泌和自分泌作用的激素样物质，其属于神经营养因子(neurotrophin，NT)的一种，其他的神经营养因子包括脑源性NGF、NT- 3、NT- 4等，NGF是保障神经存活、生长，促进神经发育、功能和可塑性的重要调节因子[8]。

NGF的作用机制NGF通过与高亲和力特异性受体酪氨酸激酶受体A(tyrosine kinase receptor A，TrkA)和低亲和力受体p75神经营养因子受体(p75 neurotrophin receptor，p75NTR)结合发挥其生物学作用。TrkA受体是典型性的酪氨酸激酶受体。TrkA受体与NGF结合，发生磷酸化，激活细胞内信号通路：丝裂原活化蛋白激酶通路、磷酸磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)通路和磷脂酶C-γ通路[9]。p75NTR可以调节TrkA受体的亲和力和选择性。NGF也可以单独与p75NTR结合激活核内因子-κB(nuclear factor kappa-B，NFκB)通路。以上所有通路均促进细胞存活和/或分化[10]。另一方面，成熟NGF的前体可以与p75NTR/分拣受体作用，诱导细胞凋亡[11]。

NGF在临床的应用现状目前，NGF在临床中主要用于治疗神经损伤和眼科疾病。NGF对胆碱能神经的完整性和功能维持发挥重要作用，有助于各种神经退行性病变中神经元的存活和再生。Rocco等[12]总结回顾了关于NGF早期和最近的临床研究，认为NGF对中枢神经系统疾病、上皮病变、角膜病变及青光眼等有治疗作用。神经生长因子临床应用专家共识也指出，应用NGF在脑卒中、颅脑损伤、脊髓损伤、周围神经病新生儿缺血缺氧性脑病、脑性瘫痪等各种神经损伤疾病中均有一定疗效[13]。另有研究显示，NGF-TrkA-p75NTR通路在结直肠癌、甲状腺癌、髓系白血病等肿瘤细胞中表达活跃，小分子抑制剂或阻断NGF-TrkA-p75NTR通路可能成为治疗肿瘤的新方向[14]。

NGF促进骨折愈合的机制

NGF促进骨折部位神经纤维生长神经系统的发育和维持被认为与骨组织的形成和愈合有关，成熟骨组织有丰富的神经纤维支配。缺少神经纤维支配，骨组织生长迟缓，痛感降低。NGF可以影响神经纤维可塑性，促进神经纤维长入骨组织[15]。Li等[16]研究发现，骨折愈合过程中骨祖细胞、成骨细胞、骨折相关巨噬细胞等表达NGF上调，在富NGF区域内，神经纤维生长较快，抑制NGF的受体TrkA受体，明显减少感觉纤维的数量，延缓骨折血管化和骨化过程。NGF促进肽能神经在骨折区域的生长和发育，这些神经纤维可释放神经肽递质，如降钙素基因相关肽，能通过刺激骨细胞有丝分裂和骨间质细胞分化达到刺激骨形成的作用；P物质在体外培养状态下也能刺激成骨细胞，使其成骨能力增强[17]。

NGF促进血管再生在骨折愈合过程中，血管的生成是骨形成和修复的基本过程之一，早期的血管再生对骨折愈合的正常进行至关重要。血管再生主要通过内皮细胞形成毛细血管从现有血管向骨折断端延伸而成。NGF通过自分泌和旁分泌参与血管内皮细胞的维持、存活、功能。Lazarovici等[18-19]和Dolle等[20]通过一系列体外内皮细胞管实验与鹌鹑绒毛膜实验证明，NGF可以促进血管内皮细胞生长，对新生血管有趋化生长作用，并且可以促进新生血管的成熟。NGF促进血管再生的机制主要有两方面：(1)NGF通过激活TrkA受体，直接促进血管内皮细胞的增殖和迁徙。Park等[21]发现NGF可以诱导人脐静脉内皮细胞的增殖和迁移，显著刺激人脐静脉内皮细胞的侵袭，主要原因是NGF-TrkA复合物激活PI3K/Akt信号通路和激活蛋白- 2转录因子刺激基质金属蛋白酶- 2(matrix metalloproteinase- 2，MMP- 2)mRNA表达及蛋白分泌。利用TrkA抑制剂K252a、PI3K/Akt均能阻断NGF诱导的MMP- 2增高，而应用MMP- 2抑制剂或在MMP- 2基因敲除的小鼠体内，NGF促进新生血管增殖和侵袭的作用显著下降；(2)NGF促进血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达。Diao等[22]发现在小鼠后肢缺血模型中，NGF转染后小鼠患肢较对照组新生毛细血管密度更高、CD34阳性细胞表达更多、肌肉萎缩程度更低，这可能与NGF转染促进VEGF的表达有关。Chen等[23]研究显示，局部应用NGF可以促进骨缺损周围组织的神经与血管再生，且促进VEGF的表达。Dolle等[20]研究显示，NGF对人类主动脉内皮细胞、大鼠主动脉内皮细胞、大鼠肾上腺髓质内皮细胞的迁徙均有促进作用，对人类主动脉内皮细胞进一步研究显示，这种促进作用与VEGF、碱性成纤维细胞生长因子等作用类似，且可以被TrkA受体抑制剂K252a阻断。

NGF调节骨细胞代谢在骨折愈合过程中，软骨细胞、成骨细胞、破骨细胞的数量、生物活性及成熟至关重要，各种细胞相互作用，完成骨的生成和重塑。NGF及其受体在骨折愈合过程中各种骨相关细胞中均有表达。于立明等[24]制作兔下颌骨横行骨折模型，于术后1、3、5、7、14、21、28 d处死动物，取下颌骨骨折处组织脱钙后制作骨组织石蜡切片，分别行HE染色、NGF及其受体免疫组织化学染色，发现在骨折愈合过程中的成骨细胞中，NGF呈阳性表达，3～5 d达到高峰；TrkA受体呈强阳性表达，7 d达到高峰，到21 d时软骨细胞表达强阳性；p75受体在骨折愈合过程中表达阳性，5～7 d达到高峰，到21 d时仍为阳性表达。一方面，NGF可以促进成骨细胞的增殖与成熟，其机制仍不完全清楚。有研究者认为，NGF与成骨细胞膜上的受体结合，使其发生磷酸化，直接调节细胞活性及功能活动，在成骨细胞分化过程中，NGF可以促进碱性磷酸酶活性，增加Ⅰ型胶原蛋白的合成[25]；Fan等[26]认为TrkA信号在主动分裂成骨细胞中具有抗凋亡作用；Johnstone等[27]利用选择性TrkA激动剂藤黄酰胺治疗小鼠腓骨骨折，显微CT和生物力学分析显示治疗后骨痂更坚固，体外分析表明，其可直接作用于成骨细胞，刺激成骨细胞成熟和矿化。另一方面，NGF调节破骨细胞活动。破骨细胞来自单核巨噬细胞系统，受NF-κB信号调解发挥骨吸收的作用。体外研究表明，NGF具有在不依赖NF-κB受体的条件下诱导破骨细胞分化的作用，可形成大量抗酒石酸碱性磷酸酶染色阳性和玻璃体蛋白结合受体染色阳性细胞，在骨吸收和骨重塑过程中发挥重要作用[28]。

NGF通过与其他细胞因子的相互作用影响骨折愈合骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein- 2，BMP- 2)是目前最肯定的具有诱导成骨作用的生长因子，在修复骨缺损及愈合中效果显著。吕桂浩等[29]应用NGF治疗合并局部神经束损伤的兔下颌骨折，结果显示神经生长因子能促进BMP- 2在骨折局部的表达，促进成骨。刘宇鹏等[30]研究也显示，NGF能促进兔桡骨骨折骨组织中BMP- 2的浓度，且使BMP- 2表达时间延长、峰值提前、下降减缓，经NGF治疗后骨折愈合更快，重塑时间提前。马聘等[31]通过观察大鼠胫骨骨折愈合过程，发现NGF能促进大鼠骨痂愈合，促进Ⅰ、Ⅱ型胶原的表达。使用NGF治疗后，骨痂的生物力学抗弯折能力更强。在骨折愈合早期，NGF能促进Ⅱ型胶原的表达，在愈合中后期，NGF能促进Ⅰ型胶原的分泌并促进骨痂骨化。胰岛素样生长因子- 1可促进骨祖细胞增殖分化，促进成骨细胞的合成代谢，促进成骨[32]。刘建军等[33]发现NGF能促进大鼠胫骨骨折断端骨痂中的胰岛素样生长因子- 1的表达，增加骨痂体积和重量，加速骨折愈合。以上研究表明，NGF促进骨折愈合可能是个复杂的多种作用途径的过程，NGF通过与表达于各种细胞表面的受体作用，促进多种生长因子的释放，在骨折局部提供一个有利于骨折愈合的微环境。

NGF促进骨折愈合的临床与实验研究

NGF促进骨折愈合的基础研究Liu等[34]分别使用NGF和NGF单克隆抗体处理兔桡骨骨折，发现治疗后24 h、48 h、1周、3周、6周、8周时使用NGF治疗的动物骨折部位VEGF表达较对照组增加，VEGF在骨折3周后达到峰值，而使用NGF拮抗剂后，骨折愈合减慢，且骨折局部的VEGF表达减少。与以往实验相比，分别从直接NGF治疗和抑制NGF表达两方面证明了NGF的促骨折愈合作用。以往研究多使用NGF局部注射观察其对骨折愈合的作用，因注射部位、注射剂量的不同，疗效不稳定，且多未研究NGF促骨折愈合的机制。Sang等[35]利用NGF转基因纯合子小鼠构建胫骨骨折模型，发现NGF转基因纯合子小鼠骨折NGF mRNA表达水平升高，骨折愈合较快，经TRAP染色及TRAP mRNA检测、番红绿染色证明NGF纯合子小鼠骨折部位破骨细胞增殖更多，软骨分化更快，其机制可能与COL2A1和SOX9表达增多有关。近期研究多认为NGF可直接调节骨细胞的代谢。崔国胜等[36]在体外使用骨髓基质细胞(bone marrow stromal cell，BMSC)研究显示，NGF通过与TrkA受体结合促进BMSC体外成骨向分化，可增强BMSC的矿化能力。NGF在骨不连的治疗中也有重要作用。刘宇涛等[37]研究显示，局部注射NGF对新西兰大白兔胫骨骨不连模型有较强的促进骨不连骨痂生长和愈合作用，NGF组12周时骨折线完全消失，达到骨性愈合，组织学检查可见骨折断端有大量活跃的成骨细胞。目前，关于NGF的基础研究虽证实了其对骨折愈合过程的促进作用，但其作用机制尚无明确阐述。各项研究多局限于探讨NGF的某一方面作用，对NGF各种作用机制之间的相互作用没有深入研究。各项研究使用的NGF剂量、注射方法、动物模型、评价指标等均不一致，缺乏统一、标准的研究模型，妨碍了对各研究的交流比较。

NGF促进骨折愈合的临床试验关于NGF对骨折患者的愈合过程影响的研究较少，且质量较低。张宏亮等[38]通过检索国内外数据库，系统评价NGF对骨折愈合的影响，共纳入5篇随机对照研究，认为mNGF可减少患者的愈合时间，但不良反应有一定增加。所纳入的随机对照研究根据推荐等级的评估、制订与评价系统推荐分级为低等级，纳入病例较少，缺乏强有力的支持证据。在最近的一项研究中，张远华等[39]应用NGF治疗创伤性骨不连患者43例(共纳入86例)，患者骨痂出现时间、骨折愈合时间均早于对照组，认为NGF对四肢骨折不愈合与延迟愈合患者有显著地临床疗效，且治疗安全性高。因国外尚未批准使用NGF治疗骨折的临床试验，研究多为在合并脑外伤等自身NGF增加的情况下，认为脑外伤合并骨折患者骨折愈合加快与NGF有关[40]。目前，NGF促进骨折愈合仍缺乏大样本、高质量的临床试验。

NGF临床应用前景及面临的问题

NGF治疗骨折愈合仍有许多问题亟待解决。NGF为大分子物质，无法通过血液循环作用于骨折局部，目前研究多采用骨折部位局部注射治疗，但此方法可能导致骨折愈合过程疼痛加重[41]。且NGF易降解，给药后24～26 h可代谢分解，使用NGF治疗骨折需大剂量、长时间持续注射，这大大限制了NGF的临床应用。随着组织工程学的发展，采用各种高分子缓释材料如聚乳酸材料、磷酸钙支架等制备NGF缓释药物或材料可维持稳定有效的NGF浓度[42]，有望解决NGF的应用限制。骨折愈合过程是复杂的，神经生长因子促进骨折愈合可能是通过多种机制，进一步的研究应侧重于NGF对各种细胞及因子的相互作用，阐述NGF的各种作用机制之间是否相互影响。

NGF可通过促进骨折断端的血管再生和神经纤维长入，调节成骨细胞和破骨细胞的代谢等方面加速骨折愈合。但目前NGF促进骨折愈合仍缺乏可信的临床证据，仍需要进一步的多中心、大样本的临床试验验证NGF促进骨折愈合的临床效果与作用机制。目前，临床上仍有5%～10%的骨折患者存在骨愈合不良或骨不连，应用安全有效、非手术方式促进骨折愈合、治疗骨不连是骨科研究的重要课题之一。局部应用NGF制剂具有安全高效、方便直接、不良反应小等优点，关于NGF的进一步研究和应用，可能会为骨不连的治疗提供一个可行的、无创的解决方案。