特洛细胞的结构特点、鉴定方法及功能的研究进展

李 腾，许 莹，姜秋燕，赵玉成，吴志正，田 虎

1山东第一医科大学第一附属医院肝胆外一科，济南 250014 2山东第一医科大学第一附属医院分院临沂金锣医院普外科，山东临沂 276000 3山东大学附属千佛山医院肝胆外一科，济南 250014

特洛细胞的发现及结构特点

1899年，西班牙解剖学家Cajal发现有一种特殊的间质细胞存在于胃肠道基层中，其外形与神经细胞极为相似，这种细胞主要是在平滑肌细胞与神经末梢之间的间隙中发现，Cajal将这种细胞称为“间质神经细胞”[1]。由于透射电子显微镜的发展，Faussone-Pellegrini等[2]揭示了人类食道和胃中这种细胞类型的超微结构。随后，Thuneberg等[3]验证了该细胞具有作为起搏器和肠道冲动导体的功能，明确这些细胞不是神经元，并将其称为Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal，ICCs)。随后的研究证明，在尿道、生殖器官、胰腺、乳腺、血管、心脏、肺脏、肝脏等多个器官中发现了另一种特殊的细胞类型，与Cajal间质细胞相似，但也有很多不同，因此将这类细胞称为Cajal样间质细胞(interstitial Cajal-like cells，ICLCs)。Popescu和Faussone-Pellegrini[4]通过大量的实验和研究证明，在电镜下可以观察到ICLCs非常特殊的细胞形态和结构，可以将其与ICCs以及别的类型的间质细胞较为显著地区分开来。除了电镜下的超微结构，它们在免疫学表型上也存在明显的差异，因此在2010年，为了避免ICLCs同ICCs以及其他间质细胞混淆，根据这类细胞的超微结构特征和免疫表型，Popescu团队将ICLCs命名为Telocytes，即我们现在所认知的特洛细胞(Telocytes，TCs)[4]。

TCs与经典的成纤维细胞或其他类型的间质细胞有很大的不同，它具有独特的超微结构[5- 6]：胞体较小呈椭圆或三角形，有细长而薄的突起(telopodes，Tps)，Tps上有狭窄节段与膨大节段交替存在。根据突起的数目不同，TCs呈现出梨形、梭状、纺锤状等形状；细胞核内大多是异染色质，周围包绕着少量胞质，胞质内有大量的线粒体，而高尔基体、粗面和滑面内质网较少。每个TCs常见2～3条Tps，可见粗细相间的串珠样外观，几十到几百微米长，细胞突起Tps可与同种细胞或其他类型细胞相互连接，从而形成复杂的3D网络[7]。

特洛细胞的鉴定方法

虽然已经在大多数组织和器官中报道了TCs，但由于Tps这种特殊结构在光学显微镜下分辨性低，因此常常被忽视。目前对TCs的原位或体外鉴别方法很多，但透射电子显微镜(transmission electron microscope，TEM)仍是鉴别TCs与不同组织间质细胞的“金标准”[8]。TEM不但能够清晰地观察到TCs的外部形态特征及内部超微结构，即Tps的膨大部分中所含有的线粒体、内质网及微囊泡等，并且对识别和了解TCs与周围细胞如心肌细胞、免疫细胞、干细胞等的连接有重要帮助[9]。基于其独特的超微结构，TCs不同于其他类型的间质细胞，相比来说，成纤维细胞胞体较大，呈多形性，高尔基体复杂，粗面内质网发育良好，细胞突起少、短、大，光镜下易于辨认[6]。Cretoiu等[10]采用最先进的电子显微镜技术-聚焦离子束扫描电子显微镜层析技术，研究了TCs网络的3D结构，利用扫描电镜对TCs进行3D重建，直观地揭示了TCs的典型特征以及TCs与其他细胞之间可能存在的联系。因此，TEM是观察和鉴别TCs形态特征及超微结构的重要手段。

研究TCs的另一种关键方法是免疫组织化学，其原理主要是通过抗原与抗体的特异性结合，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，从而对组织细胞中的特定抗原进行定位、定性或定量研究，其可行性高且操作方便。双免疫标记法是TCs半定量分析的一种有效方法，但到目前为止还没有建立单一特异性免疫表型鉴定TCs，此外，器官或组织中可能存在TCs的特异性免疫表型[11]。TCs在不同器官甚至同一器官的不同组织中呈现不同的免疫组织化学标记，可能是根据所在部位和特定组织的功能需求，从而能够促使细胞进行适应和改变。有报道TCs上c-Kit/CD117、CD34、波形蛋白，微囊蛋白1、血小板衍生生长因子受体(platelet-derived growth factor receptor，PDGFR)α、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、诱导型一氧化氮合酶免疫组织化学显色呈阳性反应[11- 12]。如TCs在心肌中c-Kit、CD34、波形蛋白和EGFR表达呈阳性，巢蛋白、结蛋白、CD13和S- 100呈阴性。CD34、c-Kit或波形蛋白的单个阳性信号不足以确定TCs，但当CD34与波形蛋白或c-Kit联合使用时，被认为是鉴定TCs最常用的标记物[13]。

血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)是间充质细胞的主要有丝分裂原，可诱导间充质干细胞的迁移和有丝分裂反应。PDGF-B由内皮细胞分泌并促进周围肌肉壁的形成。 PDGFR-β作为PDGF-B的受体，对血管稳定性很重要，而且在促进间充质干细胞的迁移和增殖中发挥重要作用。PDGFR-β阳性TCs已经发现可在骨骼肌间质中被识别，并可能在血管重塑和血管生成过程中调节微血管细胞募集过程[14]。因此，用CD34/PDGFR-β进行双阳性免疫染色被认为是鉴定TCs的有效标志物。除CD34/PDGFR-β双重免疫标记外，CD34/PDGFR-α也被认为是TCs的标志物，有研究表明，在小鼠和人类中发现的食道、胃、大肠、小肠和肝脏TCs是CD34/PDGFR-α双阳性，可以判断CD34/PDGFR-α双重免疫标记也有助于TCs的鉴定[15]。然而，CD34和PDGFR-α也在内皮细胞中表达，因此，CD34或PDGFR-α与内皮特异性标记物CD31免疫标记的组合(即CD34+/CD31-或PDGFR-α+/CD31-)可以帮助鉴定TCs[16]。

TCs的免疫组织化学特征可能在组织和器官之间有所不同。最近使用免疫染色的研究表明，脾脏中的TCs对波形蛋白、CD34、Nanog和Sca- 1呈阳性，但对c-Kit呈阴性[17]。通过TEM和免疫组织化学在人膀胱中鉴定出3种亚型的TCs，TCs亚型表达PDGFRα/calret阳性和α-平滑肌肌动蛋白/CD34/c-Kit阴性或在尿路上皮的不同位置分别为PDGFRα/calret/α-平滑肌肌动蛋白阳性和CD34/c-Kit阴性[18]。总之，CD34/波形蛋白双阳性和CD34/PDGFR-β双重阳性能够识别TCs。此外，CD34阳性/CD31阴性和PDGFR阳性/CD31阴性也是鉴定TCs的标志物[16]。因此，可以通过透射电镜和免疫组织化学相结合的方式对TCs进行更准确地鉴定和研究。

自从识别TCs以来，已经在鱼类、爬行动物、哺乳动物及人类发现了TCs的存在。其通常存在于许多器官组织的间质中，包括心脏、血管、胸膜、肺和气管、食管、肠、肝脏、胰腺、前列腺、子宫、皮肤、眼睛、泌尿系统、神经系统、运动系统等。TCs也存在于病理组织中，如乳腺癌、基底细胞癌、鳞状细胞癌等。大多数TCs具有特殊意义，通常围绕在干细胞、免疫细胞、毛细血管、神经周围或与之直接接触。因此，了解和认识TCs的功能和作用非常重要。

特洛细胞的功能和作用

关于TCs的文献越来越多，但对它们的作用仍难以明确界定。众多研究表明，TCs可能具有机械支持、免疫监视、传递细胞信号、调控干细胞微环境及干细胞分化、促进组织血管的生成、参与组织损伤的再生与修复等功能和作用。

机械支持TCs作为一种间质细胞，具有与成纤维细胞等其他间质细胞相似的机械支持作用，TCs通过与自身或其他细胞的连接，连接血管、神经纤维束和免疫细胞等，形成复杂的3D网络结构，为组织提供机械支撑[19]。如TCs网络被认为对胃肠道肌层的肌间丛的肠运动具有抵抗性和可变形性[20]。在成人神经肌肉纺锤体中，TCs定位于包膜的内层和最外层，可能通过其特殊的微环境为控制肌肉张力和运动活动提供机械支持[19]。

免疫监测TCs还在免疫监测和免疫稳态中发挥作用。越来越多的研究表明，无论是在正常组织还是在病理组织中，TCs与各种免疫细胞形成异细胞连接，如巨噬细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞等并可能调节其活性[21]。TCs可能是参与局部免疫调节或免疫监测的活跃参与者或信息提供者，在免疫炎症过程中TCs的进行性损伤和丢失可能损害细胞间通讯或免疫稳态，如多种自身免疫性疾病、慢性炎症和纤维化疾病[22]。Chi等[23]在体外实验中证明TCs可以激活和调节小鼠巨噬细胞分泌细胞因子，如白介素- 6、肿瘤坏死因子α、白介素1受体Ⅰ、白介素- 10。另外，Yang[24]推测TCs可能通过直接连接免疫复合物或间接旁分泌的方式参与免疫信号的表达和转导，影响和促进随后的免疫反应，进而改变正常的生理过程，导致免疫介导的妇科疾病或生殖异常。

传递细胞信号TCs是一种新的间质细胞类型，TCs在组织中具有“战略性”的位置，位于毛细血管和它们的特殊靶细胞(如平滑肌细胞、心肌细胞)之间，并与神经末梢密切接触。TCs参与细胞间信号传递，可以通过脱落或释放微囊泡、外泌体和其他微小分子的方式，建立直接的细胞间接触、近分泌或旁分泌，转移重要的大分子物质(如蛋白质或RNA，包括微小RNA)，将遗传信息和信号分子传递给其他细胞[4，25]。一般来说，TCs释放3种类型的细胞外囊泡：外泌体、外核颗粒体和多囊泡。囊泡中含有大量的分泌物，传递来自Tps的复杂的多分子生物信息，旁分泌介导细胞增殖、分化和组织修复，调节不同器官的生理和病理过程[26]。TCs作为激素传感器表达雌激素和黄体酮受体，通过缝隙连接或旁分泌机制参与子宫肌层收缩和输卵管运动。此外，TCs还分泌VEGF、一氧化氮、白介素- 6、一些趋化因子，甚至微小RNA来影响和调控周围细胞[27]。Cretoiu等[28]证实T型钙通道存在于人肌层的TCs中，并在激活内源性生物电信号调控肌层收缩中发挥作用。这些旁分泌介质可能对细胞间通讯(长距离)和调节邻近免疫细胞的活性至关重要。

调控干细胞微环境及干细胞分化干细胞作为组织再生的基本细胞，仅靠自我更新的能力是无法生存的，因此，干细胞巢为干细胞提供了适当的组织区域微环境，包括血管、神经末梢、细胞外基质和支持间质细胞，干细胞巢通过旁分泌方式使干细胞与邻近细胞以及远处细胞发生相互作用[29]。有证据表明，TCs与胃肠道、肺和骨骼肌、输尿管等不同器官的干细胞和祖细胞共定位[5，30- 31]。几项研究已经证实TCs存在于各种组织和器官的干细胞巢微环境中，如肺、脾、骨骼肌、乳腺、脑膜和脉络丛、肝脏、主动脉等[15，32- 34]。此外，TCs在不同组织中表达不同的干细胞标记物，如表达c-Kit、Sca-1、Oct4等，这一结果表明TCs在组织再生中发挥重要作用[35- 36]。根据两种细胞在微环境中的形态特征，TCs与干细胞之间建立直接联系，Tps包绕干细胞，形成耦联结构，并可能通过交换的大分子物质(微小RNA等)调控干细胞的分化增殖过程[37]。TCs还可通过分泌胞外囊泡进行调控转录活性及干细胞的激活[27]。无论是通过直接细胞连接，还是通过发挥旁分泌作用，TCs都积极地促进干细胞微环境中细胞信号的协调，在细胞信号传导中发挥重要作用，从而控制正常和恶性组织的微环境[38]。

需要注意的是，在2018年，Piero Anversa的31篇有关心脏干细胞的论文因涉嫌造假被撤回，Piero Anversa曾声称成熟的心脏c-Kit干细胞能修复心肌，全球有很多科学家投入到对心脏干细胞的研究中，但最终被证实并不存在心脏c-Kit干细胞的心肌修复功能，目前大量关于心脏干细胞的研究被撤稿。自此丑闻后主流观点认为成人心脏中不含自身干细胞。不能否认的是，认为心脏自身干细胞不存在，但可能有其他来源的干细胞修复心肌，如间充质干细胞、诱导式多功能干细胞等。2018年心脏再生领域的震动使我们对有关TCs和心脏干细胞的研究表示怀疑，但关于TCs对心脏具有修复功能的证据仍然是存在的，其修复机制还需进一步研究。

促进组织血管的生成血管生成是一种常见的生理和病理现象，包括血管内皮细胞的增殖、基底膜的酶降解和内皮细胞间质基质的降解、血管内皮细胞的迁移，最终由新生血管内皮细胞形成血管。血管生成可以通过VEGF与表皮生长因子结合，激活VEGF和表皮生长因子受体，诱导血管内皮细胞成管，促进细胞增殖和血管通透性，维持新生血管[39]。

TCs位于血管的细胞外基质中[6]，存在于许多器官和组织中的小动脉、静脉和毛细血管内，特别是心脏和肺。例如，急性心肌梗死小鼠心脏新毛细血管周围的TCs数量显著增加，表明TCs可能参与毛细血管的血管生成[40]。Zhao等[40]将纯化的、培养的心脏TCs移植到心肌梗死大鼠上，可以缩小梗死面积，改善心肌功能，这些改善可能与损伤心肌细胞网状结构的重建有关，使血管生成增加，降低心肌纤维化程度。在对肺TCs的研究中，Hussein等[41]证实，肺TCs广泛存在于发育中的细支气管周围和血管壁内，TCs与周围间质中大量扩张的薄壁毛细血管密切相关，与发育中的内皮细胞有明显的接触，一些TCs参与了内皮细胞和肺泡细胞的发育，参与构成了气-血屏障。Zheng等[42]研究表明人肺TCs中VEGF和表皮生长因子的产生显著增加，对表达于造血干细胞表面的CD34和c-Kit呈阳性反应，被认为参与了血管生成。在骨骼肌的研究中发现骨骼肌间质中表达VEGF、PDGFR-β和增殖标志物Ki-67、Oct4[14，35]，可能在骨骼肌损伤修复过程中参与血管生成和血管稳定性。因此，可以推测TCs促进了组织修复过程中的血管生成。

参与组织损伤的再生与修复在目前的众多文献中，对TCs的功能作用研究多集中在其对组织损伤修复的能力和再生潜能。

成熟的心肌细胞没有再生能力，其损伤后的修复可能与TCs有关。来自超微结构的研究表明TCs在心脏间质形成一个3D网络，参与血管的结构组成，支持神经系统、免疫系统、间质组织和心肌细胞，可能协调心脏的更新、再生和修复。Miao等[43]的研究表明心脏TCs易发生缺血性损伤，在心肌梗死期间，TCs的间质骨架迅速被破坏，TCs明显减少。研究表明将心脏TCs移植到心肌梗死大鼠上，可以缩小梗死面积，改善心肌功能[40]。Ibba-Manneschi等[44]提到，在实验中可观察到TCs在衰老的心脏和心力衰竭中降低，衰竭的心脏中可见凋亡改变。在心肌梗死的纤维化区可见TCs的缺失，而新生培养的毛细血管中可见较多的TCs分布，表明TCs在血管生成中发挥了作用，多能干细胞移植可减少受损心肌的大小，同时增加TCs的存在。因此，心脏TCs的应用可能是心肌梗死的一种未来的治疗方法。

在Wang等[15]的研究中，通过建立肝部分切除术小鼠肝脏再生模型，评估肝脏再生的质量，再生肝组织被免疫荧光双染色，结果显示术后72 h时双染色TCs数目明显增加，符合肝部分切除术后细胞的最大增殖点，提出TCs可能参与了肝脏损伤后的肝细胞再生。Fu等[45]收集通过肝活检获得人肝纤维化标本，研究TCs与肝纤维化的关系，得出纤维化组织中TCs明显减少的结论。TCs可能在肝脏再生修复中发挥重要作用。

TCs已被证实存在于人类和小鼠的呼吸道，包括肺泡管以及终末端呼吸性细支气管。Zheng等[46]对小鼠肺TCs的基因谱进行了深入研究，并与肺间充质干细胞和成纤维细胞进行了比较，发现至少有46个基因在TCs、间充质干细胞和成纤维细胞中被发现有功能连接。因此，推测肺TCs具有多种功能作用，包括组织发育和再生、细胞外基质重构和新生血管形成，特别强调它们在维持血管基底膜完整性方面的潜在作用。此外，肺TCs表达Oct4[36]，该标记物通常在胚胎干细胞中表达，这一发现促使人们推测TCs可能是干细胞的一个亚群。

TCs在骨骼肌间质中构成一个3D网络，分布在毛细血管、神经纤维、肌细胞和卫星细胞的周围，TCs与两种类型的肌间充质干细胞(卫星型和非卫星型)之间密切接触，可见Tps[35，47]。体外研究表明，与TCs共培养时，骨骼肌源性干细胞分化为脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞的能力更好，这一发现强调了TCs在组织再生和修复中的潜在作用[35]。

有报道与健康对照组相比，系统性硬化症和克罗恩病患者回肠TCs减少[48]。在对硬皮病皮肤样本的研究中发现，TCs的数量在干细胞巢中减少。此外，在弥漫性皮肤硬皮病中，血管周围间隙不能观察到干细胞。因此，硬皮病患者TCs的减少可能与皮肤修复和再生功能受损有关。在Mirancea等[49]对基底细胞癌和鳞状细胞癌的研究中发现与正常皮肤相比，肿瘤中TCs细胞与其他类型细胞局限性连接，提示可能参与诱导细胞间通讯改变并进入瘤周基质，进而进入整个肿瘤肿块。Mou等[50]将TCs与乳腺癌EMT- 6细胞共培养时发现TCs对癌细胞有促进增殖、抑制其凋亡的作用。

综上，虽然人们对TCs的认识在不断加深，但其生物学功能尚不完全明确，应寻找不同组织和器官中TCs的特异性标记物，并加强机制层面的研究，充分发掘其在生理和疾病过程中发挥的作用。希望在新的角度去认识TCs，例如可以通过TCs微小RNA、代谢组学、蛋白组学等的研究揭示其特殊作用。相信随着对TCs研究的更加深入，TCs可能会成为预防和治疗各种疾病的新靶点。