自噬性细胞死亡与凋亡相互影响作用的研究进展

王欣琦，贾颜鸿，周 童，栗 达，王 莉，张泽兵*

(1.吉林大学口腔医院 病理科，吉林省牙发育及颌骨重塑与再生重点实验室，吉林 长春130021；2.吉林市中西医结合医院)

生物体都在不断地更新，细胞和细胞内的成分不断地被重塑和循环利用，因此，都会发生低水平的基础性自噬，以执行细胞稳态功能。例如细胞通过自噬分解异常蛋白质和受损细胞器，获得可供循环利用的核苷、氨基酸等大分子物质及能量，从而维持细胞代谢平衡。然而自噬又是可以高度诱导的，尤其是在细胞内和(或)细胞外应激的情况下，例如营养匮乏、缺氧、氧化应激、代谢失衡、致癌基因激活、病原菌感染时，诱导细胞启动自噬作用，从而对机体起到保护作用[1]。在大多数情况下，自噬是构成促进细胞存活的应激适应途径。但一个明显的矛盾是如果在发育过程中给予持续的应激刺激导致过量的自噬就会导致细胞死亡，一种被称为“Ⅱ型”或“自噬”细胞死亡的非凋亡性程序性细胞死亡。从凋亡机制中明确区分非凋亡细胞死亡机制对哺乳动物细胞是很困难的。有研究发现，某些自噬相关基因也调节细胞凋亡，同时，在细胞凋亡机制中处于中心地位的Caspase半胱氨酸蛋白酶家族也参与调控自噬性细胞死亡过程[2]。找出与凋亡和自噬相关细胞死亡之间有关的“切换”或调节机制，有望成为癌症治疗学的新靶点。

1 自噬相关基因参与调节细胞凋亡过程

凋亡和自噬途径之间存在串扰，自噬通过提供能量以允许需要能量的程序化细胞死亡过程完成，以及以自身的方式降解细胞材料，从而有助于促进细胞凋亡。

1.1 Bcl家族通过Beclin 1调控自噬从而影响细胞凋亡

Beclin 1/Atg 6/BECN 1是一种在自噬的起始过程中起着关键性作用的蛋白质，用于激活Ⅲ类磷脂酰肌醇-3-激酶[3]，ATG 6/Beclin-1与Ⅲ类PI3-激酶信号复合物协同作用下积极控制自噬泡的形成[4]。虽然自噬具有抗凋亡作用，但在非凋亡的死亡细胞中自噬小体数量的增加与非凋亡细胞死亡的形式有关。由于自噬是一个动态的自降解过程，大规模的细胞破坏会导致不可逆转的细胞萎缩和细胞崩溃。由此可推断凋亡和自噬可能有共同调控的方向，因为抗凋亡Bcl-2和Bcl-xl蛋白通过与Beclin 1(哺乳动物Atg6)结合而负调控自噬。抗凋亡蛋白Bcl-2与自噬蛋白Beclin 1的相互作用是凋亡机制和自噬机制潜在的重要汇合点[5]。

1.1.1Bcl-2被磷酸化后与Beclin 1的BH3结构域发生解离，而引发自噬

Bcl-2蛋白家族，Bcl-2，Bcl-xl和Mcl-1是众所周知的抗凋亡介质，但其在抑制自噬中的作用正日益被人们所了解。Bcl-2蛋白的离子来源于其拮抗Bax和Bak的能力，从而阻止凋亡。Bcl-2和Bcl-xl在抑制凋亡和自噬相关细胞死亡中的双重作用使这些蛋白成为理想的化疗靶点。Beclin 1和Bcl-2的表达水平是决定细胞在肿瘤发生和化疗过程中是否能抵抗凋亡或自噬的关键因素。人BECN1包含一个BH3结构域[6]，Beclin 1已被证明通过其BH3结构域与抗凋亡Bcl-2家族成员相互作用。当Bcl-2被磷酸化后并与Beclin 1发生解离，就会引发自噬[7]。如果继续激活JNK1通路并保持Bcl-2磷酸化，细胞还会发生凋亡[8]。

1.1.2不同营养状态下调控Bcl-2与Beclin 1的结合而调控自噬

Bcl-2抑制Beclin 1依赖自噬的发现提出了生理自噬是如何在表达Bcl-2和Beclin 1的正常细胞中发生的问题。研究结果表明，内源性Bcl-2与内源性Beclin 1结合，这种相互作用受细胞营养状态的调节[5]。当氨基酸饥饿引起最大自噬时，Bcl-2与Beclin 1的结合量很小。当氨基酸过量抑制自噬时，Bcl-2与Beclin 1结合最大。因此，在饥饿和其他潜在的生理刺激的反应下，Bcl-2与Beclin 1的解离可能是激活Bcl-2自噬的重要机制。相反，Bcl-2和Beclin 1在正常生长条件下的结合可能是防止不适当的自噬的机制之一。此外，饥饿诱导的JNKI激活可引起Bcl-2的BH4和BH3结构域之间的多位点磷酸化，从而破坏Bcl-2和Beclin 1的相互作用[9]。

1.1.3Caspase通过切割Beclin 1而抑制自噬

同时，有研究发现caspase可以在细胞凋亡中切割Beclin 1，从而破坏其自噬活性。例如，caspase-3，-7和-8介导的Beclin 1的切割产生N-端和C-端,促凋亡蛋白Bax诱导的凋亡通过增强caspase介导的Beclin 1在D149的断裂而减少自噬[10]。断裂后，N端和C端的Beclin 1片段都改变了其定位，这些片段与Vps 34不正常相互作用，而Vps 34又是自噬所必需的。Beclin 1的切割是caspase抑制自噬的关键事件，就像一个不能被切割的Beclin 1突变体在过度表达Bax的细胞中恢复自噬一样[11]。由此可以发现细胞凋亡可以抑制自噬。

1.2 Atg 5和FADD在自噬细胞死亡中的重要作用

自噬相关基因Atg5是自噬小体形成所必需的蛋白质，是干扰素g诱导的自噬细胞死亡所必需的。用短干扰RNA(SiRNA)沉默Atg5基因会导致部分耐药。细胞凋亡与钙蛋白酶介导的Atg 5切割有关，而Atg 5的断裂与细胞类型和凋亡刺激无关，提示钙蛋白酶激活和Atg 5断裂是凋亡细胞的普遍现象。Atg 5由胞浆转运至线粒体，与抗凋亡分子Bcl-xl相关[12]，并触发细胞色素c释放和caspase活化。加在一起，钙蛋白酶介导的Atg 5切割，截短的Atg 5可能通过阻断Bcl-xl的功能而促进细胞凋亡，从而导致Bax的激活，导致凋亡细胞死亡[13]， 因此，代表了自噬与凋亡之间的分子联系，这一发现对临床抗癌治疗具有潜在的重要意义。

1.2.1IFN-γ或Atg5表达引起空泡积聚从而导致细胞死亡

Atg5还可能在自噬和自噬细胞死亡中起双重作用。在自噬过程中，Atg5是一种独特的非泛素结合反应的组分之一，它是液泡形成所必需的。IFN-γ或Atg5表达引起的空泡积聚的细胞死亡，液泡形成先于细胞死亡。Atg5(K130r)突变体可阻断IFN-γ诱导的细胞死亡和空泡形成，Atg5在体外和体内通过死亡域与FADD相互作用，其介导的细胞死亡而非空泡形成在FADD缺陷细胞中被阻断。提示Atg5与FADD相互作用在IFN-γ诱导的自噬细胞死亡中起重要作用[14-16]。

1.2.2Atg5通过其Lys残基与Atg12结合，并与FADD结合以诱导细胞死亡

在细胞死亡压力存在的情况下，自噬和自噬细胞死亡可能共用Atg5的机制。Atg5的中端和C端含有一个Lys残基与Atg12结合，并与FADD结合以诱导细胞死亡。此外，Atg5(K130r)突变体与Atg12结合能力缺陷的观察表明，Atg5与Atg12的结合也与液泡相关的细胞死亡类似。说明Atg5介导的细胞死亡可能需要Atg12的参与。

1.2.3FADD作为Atg5诱导自噬细胞死亡的下游介质调控其反应过程

通过酵母双杂交筛选，可以确定Atg5是一种与FADD死亡结构域相互作用的蛋白。令人惊讶的是，随后的研究分析显示Atg5的促细胞死亡活动需要FADD作为下游介质。虽然FADD的过度表达可能激活含有caspase-8等死亡效应区，但FADD的减少可使Atg5诱导的自噬细胞死亡。FADD是一种主要由受体介导的细胞凋亡的适配器分子。然而，许多证据表明，FADD是一种多功能蛋白，在非受体介导的凋亡、坏死和细胞生长中表现出不同的活性。因此，FADD可能是决定各种信令命运的转折点。阐明含有FADD的配合物(如FADD-Atg5和FADD-caspase)的信号依赖化学计量学将是非常重要的。目前，研究人员并不认为与FADD相互作用的caspase-8对Atg5介导的细胞死亡有显著的促进作用。由FADD-DD和Atg5触发的有效细胞死亡表明FADD-DD可能起到激活自噬细胞死亡的下游介质的作用，而FADD-DED(死亡效应结构域)通常是细胞死亡所必需的[14]。

1.3 Atg4D可能通过线粒体途径增强凋亡反应

1.3.1Atg4D作为caspase-3在细胞凋亡过程中的一种底物

Atg4D是细胞自噬与凋亡调控界面的重要因子。Atg4D的扩展N端包含一个典型的caspase切割序列(DEVD63K)。其延伸的N端构成自抑制，caspase的裂解通过去除这个自抑制结构域来刺激活性。通过比较高表达全长突变体和ΔN63-Atg4D(野生型和C144A活性位点突变体)的效果，发现Atg4D介导的细胞毒性并不是由自噬能力改变引起的。有研究发现Atg4D是caspase-3在细胞凋亡过程中的一种底物，其切割产生截短的产物，增强了GABARAP-L1的体外启动活性，并在人细胞中过表达时诱导细胞死亡。

1.3.2线粒体通过BH3的C-末端靶向Atg4D产生细胞毒性并与Bcl-2家族相互作用而促进凋亡

有数据还表明Atg4D是一个重要的细胞存活因子，因为沉默Atg4D的表达会使细胞对饥饿和葡萄球菌毒素引起的细胞死亡敏感。同时,caspase裂解使Atg4D对哺乳动物细胞也产生毒性。Atg4D介导的细胞毒性并不是由于自噬改变所致，而是由线粒体通过其BH3的C-末端靶向Atg4D所致，并与Atg4D与线粒体的短暂联系有关。Atg4D的caspase切割可能也暴露了BH3结构域[17]。BH3结构域在插入多结构域Bcl-2家族成员的疏水裂缝时起促进凋亡的作用[18]。但Atg4D是否可以通过靶向Bax或Bak而导致凋亡前线粒体因子的释放仍然是未知的。

2 凋亡相关蛋白参与调控自噬性细胞死亡

最近的证据表明，Atg蛋白本身可以作为半胱氨酸蛋白酶的靶点，提供潜在的自噬调节以及发现来自Atg蛋白片段的新功能。

2.1 caspase-8切割Atg3蛋白对受体激活细胞死亡过程中自噬的调节作用

Atg3是自噬相关泛素化类系统的一个组成部分，参与自噬体的形成[19]。研究人员在Atg3序列中发现了一个caspase-8靶位点[20]，在Atg3中，caspase-3、-6或-8的裂解位点被预测落在其与Atg7、s6相互作用所需的区域，Atg7和Atg3是分别催化Atg8(LC3、GATE-16或GABARAP)脂质化的E1和E2酶[21]。

TNF-a通过与其受体TNFR 1和TNFR 2结合而激活细胞死亡。相反，另一种死亡配体TRAIL通过其对不同类型死亡反应的作用，导致caspase-8的激活。在caspase-8激活后，Atg3发生断裂或降解。细胞死亡期间Atg3的切割可能是死亡受体刺激和caspase-8活化下游事件的结果。caspase-8的过表达导致Atg3的降解，这一过程依赖于caspase-8的酶活性。Atg3上caspase-8切割位点的突变在体外均能抑制caspase-8的切割[20]。Caspase-8介导的Atg3蛋白的切割阻断了死亡受体在配体结合后触发的信号的自噬臂。重新引入caspase-8抗性Atg3或通过caspase抑制阻断Atg3切割，揭示死亡受体途径的自噬相关信号。有研究显示Atg5或Atg3的缺失抑制自噬体的形成，从而明显抑制caspase-8的活化和凋亡[22]。

2.2 caspase-3切割Beclin 1可能导致自噬失活，从而导致凋亡增加

有研究发现Beclin 1中发现了两个caspase-3切割位点，它们可能参与了自噬和凋亡的调控。Beclin 1是caspase-3的底物，分别在位置124和149处有两个裂解位点，该裂解位点通过抑制自噬作用促进凋亡活性细胞的凋亡。这可能是由于这些位点的突变导致这种蛋白质的构象改变。Beclin 1在这两个位点的断裂也可能导致BH3结构域的暴露，从而获得促进细胞凋亡的功能。曾有研究人员发现单用Beclin 1(D 150-450)的N端裂解产物就足以诱导细胞死亡，而不受任何凋亡刺激的影响。在caspase-3切割后，Beclin 1的BH3结构域暴露可能通过直接结合Bcl-2家族中的其他抗凋亡成员来增强细胞凋亡，并允许仅有促凋亡BH3的分子竞争Beclin 1与Bcl-2/Bcl-xl的结合，导致细胞凋亡[9]。因此，研究Caspase-3对Beclin 1的裂解是否会影响Bcl-2和Beclin 1之间的相互作用是很有意义的。

3 小结

自噬与细胞死亡的确切关系是近年来争论的焦点。在许多系统中，自噬和凋亡同时被激活。自噬和凋亡都是高度调控的生物学过程，在组织内稳态、发育和疾病中发挥重要作用。尽管自噬和凋亡在一些分解代谢过程之间有明显的差异，但他们却是紧密相连的。在大多数情况下，自噬为保护性自噬，与凋亡之间多为抑制作用。Caspases在细胞凋亡中起关键作用，在引导自噬-凋亡串扰中起关键作用。在某些特殊情况下，自噬前蛋白甚至可以被转化成促凋亡蛋白，从而在被半胱氨酸蛋白酶切割后介导细胞凋亡。另一方面，自噬可以通过调节caspase的数量和活性来影响凋亡级联。因此，有必要进一步研究半胱氨酸蛋白酶和Atg蛋白之间的相互作用在动物模型和人类临床模型中自噬-凋亡串扰中的作用。由于自噬细胞死亡既有caspase依赖性的，也有与caspase无关的。尽管进行了大量的研究，但自噬性细胞死亡主要是根据形态学标准和形态学特征来评估的，而自噬与细胞死亡联系的确切机制仍有待于充分了解。