赤眼蜂分子鉴定研究进展

严智超，华海清，李元喜

(南京农业大学昆虫学系，南京 210095)

赤眼蜂Trichogrammaspp.隶属膜翅目Hymenoptera小蜂总科Chalcidoidea，赤眼蜂科Trichogrammatidae，是世界范围内应用最广泛、最成功的一类卵寄生蜂，已被广泛应用于水稻、玉米、棉花、果蔬、林木等多种农林害虫的防控，取得了显著的经济和生态效益(Smith, 1996; 何晓芳等, 2005; 张俊杰等, 2015)。赤眼蜂属种类繁多，已报道有200余种，其寄主范围广泛，可寄生鳞翅目、半翅目等7个目500多种昆虫的卵，其中特别对鳞翅目农林害虫的防控作用尤为显著(Pinto, 1999; 胡红英, 2003)。不同赤眼蜂对不同寄主和生境具有偏好性，其种类和品系的选择是影响其田间防效的重要因素。此外，对于监测、避免赤眼蜂人工繁育中的蜂种混杂以及追踪、评估其田间释放后的防控效果，赤眼蜂的鉴定无疑都是至关重要的(胡红英, 2003; Stouthamer, 2006)。

然而，由于赤眼蜂体型微小(仅0.5 mm左右)，又缺乏明显的种间形态差异，其分类鉴定一直是研究的难题(Nagarkatti & Nagaraja, 1977; 胡红英, 2003; 何晓芳等, 2005)。早期研究曾以赤眼蜂体色、触角、翅毛等特征进行分类鉴定，造成了许多混乱。其中一个原因是，赤眼蜂的这些性状具有发育可塑性(Pintoetal., 1989)。如，松毛虫赤眼蜂T.dendrolimi在25℃以上培养出来的雌蜂呈通体黄色，而在接近发育起点温度培养的则呈通体黑褐色。Flanders和Quednau(1960)提出了应在相同温度、湿度和寄主条件下进行赤眼蜂培养用以准确鉴定，但由于操作繁琐未能推广开来。一些学者先后逐渐认识到赤眼蜂雄外生殖器在其分类鉴定中的重要性。Nagarkatti和Nagaraja(1968，1971)率先系统性地对雄外生殖器特征进行了描述，并以此为主要分类鉴定依据，开启了赤眼蜂的现代分类学研究。此后，雄外生殖器快速成为本属分类鉴定所用的普遍特征，赤眼蜂属的分类研究也从1971年仅知的十余种(Nagarkatti & Nagaraja, 1971; 何晓芳等, 2005)发展至今报道有200余种(Pinto, 1999; Stouthamer, 2006)。

但基于赤眼蜂形态的传统分类鉴定仍存在以下明显缺陷：(1)对专业技术要求高，且耗时费力；(2)难以区分一些近缘种，也无法鉴定隐存分类单元；(3)无法鉴定残缺标本，及雄蜂之外的其他发育阶段；(4)难以鉴定孤雌产雌的赤眼蜂品系(Stouthameretal., 1999; Stouthamer, 2006)。因而，赤眼蜂的分类研究亟需更准确、便捷、高效的鉴定方法。近年来，随着分子生物学技术的发展，越来越多的分子鉴定技术被应用于赤眼蜂的分类鉴定，对基于形态特征的传统分类鉴定予以了丰富与补充。本文就赤眼蜂属分子鉴定中常用的方法进行简短的综述。

1 分子标记的选择

大量的研究表明，选择合适的分子标记是成功分子鉴定的关键(Behura, 2006; Stouthamer, 2006; 黄帅和胡红英, 2006; Gariepyetal., 2007)。在赤眼蜂分子鉴定的研究中，常用的分子标记有同工酶，如酯酶等，以及DNA片段，如微卫星DNA(Microsatellite DNA)、核糖体DNA、线粒体DNA等。

同工酶具有多态性，可用于赤眼蜂种间的区分鉴定。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法对蛋白质进行分离，然后对同工酶的酶谱进行分析，根据同工酶谱带的不同，对物种、群体进行鉴定，即同工酶电泳法(Isoenzyme Electrophoresis)(Murthyetal., 2013)。Voegele和Berge(1976)首次将该方法引入赤眼蜂分子鉴定的研究。之后，同工酶电泳法在赤眼蜂分子鉴定研究中主要流行于20世纪80至90年代(何晓芳等, 2005)，主要采用的同工酶标记有酯酶、苹果酸脱氢酶、过氧化物歧化酶等，其中最常用的标记为酯酶(Kazmer, 1991; 黄寿山等, 1991; Pintureau, 1993; 霍绍棠等, 1994)。然而，同工酶等蛋白质与DNA分子标记不同，容易降解、失活，需要大量的新鲜或冻存的样品，且同工酶的丰度、活性也可能受到发育阶段、性别、环境等影响(何晓芳等, 2005; Murthyetal., 2013; Yazlovetskyetal., 2015)。因此，同工酶电泳法也逐渐在赤眼蜂分类鉴定研究中被舍弃。

随着PCR(Polymerase Chain Reaction)技术的发明与普及，DNA分子标记越来越多地应用于赤眼蜂分子鉴定的研究(Stouthamer, 2006; 黄帅和胡红英, 2006)。相较于蛋白质，DNA分子可通过PCR进行特异性扩增，从而大大减少对初始样本量的需求，十分适合赤眼蜂等微小昆虫的分子鉴定。另，DNA不具有发育可塑性，对不同的发育阶段均可以鉴定。其中，在赤眼蜂分子鉴定中，采用的DNA分子标记有微卫星DNA、核糖体DNA和线粒体DNA。

微卫星DNA也被称作简单重复序列(Simple Sequence Repeats，SSR)或短串联重复序列(Short Tandem Repeats，STR)，由1～6个碱基的重复单元组成(Richardetal., 2008; Gulcher, 2012)。SSR广泛分布于真核生物的整个基因组，较基因组其他区域具有更高的突变速率，也更为丰富的多态性，因而常被用于群体结构分析、遗传图谱绘制、个体杂合度检测等多个领域(Gulcher, 2012)。然而，SSR分析的方法开发常需要文库构建和筛选，以获得微卫星两侧的序列用于引物设计，成本较高且耗时费力，一定程度上限制了其广泛应用(Zaneetal., 2002)。基于SSR分析的基础，Zietkiewicz等(1994)进一步提出简单重复序列间区(Inter-Simple Sequence Repeat，ISSR)分子标记技术。ISSR分析的引物即为在SSR序列的3′端或5′端加上2～4个随机碱基，用于扩增引物锚定的重复序列间的间隔DNA片段。ISSR分析无需靶序列的背景信息，较SSR更便捷高效，但由于是随机引物锚定，其重复性不及SSR(Zietkiewiczetal., 1994)。在赤眼蜂分子鉴定研究中，SSR和ISSR分析的应用都较少，主要应用于赤眼蜂杂合度的检测和种内不同种群间的区分(Landaisetal., 2000; Vavreetal., 2004; Borbaetal., 2005; Pizzoletal., 2005; 付海滨, 2006; 付海滨等, 2006; 裴毅夫等, 2009; Lu & Han, 2016)。

核糖体DNA是分子鉴定中常用的分子标记。核糖体DNA在基因组中具有大量的拷贝数，即使DNA部分降解，也可以成功扩增。一个核糖体DNA转录单位由转录区和非转录区两个部分组成，包括3个基因18S、5.8S、28S及两个内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer，ITS)，即ITS1和ITS2(Wellauer & Dawid, 1977; Srivastava & Schlessinger, 1991)。其中，ITS不直接编码核糖体RNA，其进化速率相对较快，即使在近缘物种中也会出现长度及序列的差异，因此可以用于物种的鉴定及系统发育关系的解析。其中，ITS2被广泛用于赤眼蜂的分子鉴定中，对美国、葡萄牙、澳大利亚、中国、南非、印度等多个国家地区的赤眼蜂展开了分子鉴定的研究(Silvaetal., 1999; Stouthameretal., 1999; Querinoetal., 2001; Pintoetal., 2002; Li, 2007; Kumaretal., 2009; Sumeretal., 2009; Karimietal., 2012; Poorjavadetal., 2012; Nasiretal., 2013; Zoubaetal., 2013; Almeida & Stouthamer, 2015)。然而，核糖体DNA无法区别一些近缘的赤眼蜂种。如，ITS2无法区分微小赤眼蜂T.minutum及其近缘种T.platneri(Stouthameretal., 2000)，而线粒体分子标记COII则可将其区分(Borghuisetal., 2004)。此外，核糖体DNA在同一个体的多个拷贝间存在序列多态性，如ITS2的不同拷贝在同一个个体中可达到4%的序列差异(Richetal., 1997)，这给后续的限制性内切酶鉴定、测序分析等带来了一定的不便和不确定性。

另一类常用的分子标记是线粒体DNA。与核糖体DNA不同，线粒体DNA经母系遗传，同一个体内不具有异质性(Cameron, 2014; Hill, 2015)。另，昆虫线粒体基因的进化速率远高于核基因，这种现象在赤眼蜂等膜翅目昆虫中尤为明显(Yanetal., 2019)。同样的，线粒体基因也存在大量的拷贝数，容易扩增(Cameron, 2014)。由于种种优点，线粒体DNA被广泛应用于物种的分子鉴定，线粒体基因COI更是被选为通用的物种条形码(Cameron, 2014)。在赤眼蜂分子鉴定研究中，曾采用的线粒体分子标记有COI、COII、Cytb等，其中COI应用最为广泛(Borghuisetal., 2004; 付海滨, 2006; Huaetal., 2018)。但相较于ITS2，COI在赤眼蜂分子鉴定研究中起步较晚，研究也相对更少。然而，通过对19种赤眼蜂ITS2和COI两个基因的系统发育分析，Thiruvengadam等(2016)(Venkatesanetal., 2016)发现COI比ITS2具有更高的变异率，也更适合赤眼蜂属不同种的区分与鉴定。

2 常用分子鉴定方法

1985年，Kary Mullis发明了PCR技术(Saikietal., 1985; Mullis, 1990)。目前常用的赤眼蜂分子鉴定技术大多都是基于PCR技术发展而来，如对全基因组进行PCR扩增的随机扩增多态性DNA分析(Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)、针对特定DNA片段的物种特异性PCR(Species-specific PCR，SS-PCR)，以及对DNA片段进行PCR扩增后的鉴定，如限制性内切酶片段长度多态性分析(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)、高分辨率熔解曲线分析(High Resolution Melting Analysis, HRM)、测序比对等。

2.1 RAPD

随机扩增多态性DNA分析(以下简称RAPD)是由John Williams和John Welsh分别领导的两个小组几乎同时发明于1990年，是一种建立在PCR基础上进行DNA多态性分析的分子技术(Jainetal., 2010)。其原理是设计一系列随机引物，对研究对象的基因组DNA进行PCR扩增，并将所得PCR产物进行凝胶电泳分析，通过扩增产物的多态性反映基因组DNA的多态性，从而用于物种鉴定、系谱分析等(Jainetal., 2010)。RAPD不需要基因组的前期信息，操作也相对简单。Landry等(1993)用随机引物对短管赤眼蜂T.pretiosum等3种赤眼蜂进行了总基因组的RAPD分析。Vanlerberghe-Masutti(1994)对广赤眼蜂T.evanescens等7种赤眼蜂所提取的线粒体DNA进行了RAPD分析。此后，Chang等(2001)、Li(2007)、Singh等(2008)、Ercan等(2012)等研究者也尝试利用RADP用于赤眼蜂的分子鉴定。但是，RAPD对模板要求高，重复性差，且易受外来污染DNA(如寄主、共生菌等)的影响(Stouthamer, 2006; Li, 2007)。因此，RADP在赤眼蜂分子鉴定中也未能推广开来。

2.2 PCR-RFLP

限制性内切酶片段长度多态性分析(以下简称RFLP)是根据不同生物体内某一区段的DNA序列存在多态性及限制性内切酶识别具有专一性的特征，用一种或多种限制性内切酶将不同生物体的同一基因片段分割成大小不同的片段，根据酶切后片段大小达到区分物种的目的(何晓芳等, 2005; Stouthamer, 2006)。早期，研究者曾直接对提取的赤眼蜂线粒体DNA进行RFLP分析。Vanlerberghe-Masutti(1994)选用了11种限制性内切酶对7种赤眼蜂的线粒体DNA进行RFLP分析，并基于酶切片段长度的多态性尝试对7种赤眼蜂的进化关系进行解析。然而，直接提取线粒体DNA对样本量的需求较大。后来，人们主要采用先PCR对特定DNA片段进行扩增，再进行RFLP分析，并逐渐成为了赤眼蜂分子鉴定的重要方法(Stouthamer, 2006)。

其中，基于ITS2分子标记的PCR-RFLP研究最多，迄今已对来自美国、葡萄牙、中国、澳大利亚、印度、南非等多个国家地区的至少40余种赤眼蜂建立了基于ITS2的PCR-RFLP图谱(Silvaetal., 1999; Stouthameretal., 1999; Querinoetal., 2001; Pintoetal., 2002; Li, 2007; Kumaretal., 2009; Sumeretal., 2009; Karimietal., 2012; Poorjavadetal., 2012; Nasiretal., 2013; Zoubaetal., 2013; Almeida & Stouthamer, 2015)。如，Stouthamer等(1999)采用MseI、EcoRI和MaeII三种限制性内切酶，对北美地区的短管赤眼蜂T.pretiosum等7种赤眼蜂建立了基于ITS2序列的PCR-RFLP分子检索表。Silva等(1999)选用ITS2为标记基因，采用限制性内切酶MnlI区分了葡萄牙常见的6种赤眼蜂。类似地，Li等(2007)采用限制性内切酶EcoRI和HindIII对ITS2序列进行PCR-RFLP分析，进而区分鉴定中国4种常见的赤眼蜂，即松毛虫赤眼蜂T.dendrolimi、玉米螟赤眼蜂T.ostriniae、拟澳洲赤眼蜂T.confusum和广赤眼蜂T.evanescens。另，COI、COII、Cytb和ITS1等多种分子标记也曾被用于赤眼蜂的PCR-RFLP分析(Sappaletal., 1995; Borghuisetal., 2004; 付海滨, 2006; Huaetal., 2018)。如，Hua等(2018)基于COI序列，采用了EcoNI、SspI和VspI三种限制性内切酶，建立了稻螟赤眼蜂T.japonicum等8种赤眼蜂的PCR-RFLP分子检索表。

PCR-RFLP不受赤眼蜂的发育阶段、性别等限制，结果准确稳定、操作也相对简单，为传统形态鉴定提供了有效的补充，已被广泛地应用于赤眼蜂的鉴定(Stouthamer, 2006; Gariepyetal., 2007)。但其缺点是只能鉴定限制性内切酶识别位点序列的变异，并且这些酶切位点在种内也可能因突变存在异质性，从而对鉴定结果造成一定影响。

2.3 物种特异性PCR

物种特异性PCR就是基于物种的DNA保守序列，设计物种特异性引物，再通过PCR扩增和凝胶电泳技术，直接通过目标片段的有无或长短来进行鉴定(Gariepyetal., 2007)。相对于PCR-RFLP，该方法省去了限制性内切酶酶切的步骤，是赤眼蜂分子鉴定中一种较为快捷、高效的方法。而其最重要和最困难的部分是物种特异性引物的设计(党向利，2003)。理论上，设计物种特异性引物需要测定该赤眼蜂种间与种内的变异，进而确定种间特异、种内保守区域的序列。因此，研究者往往采用尽可能多的样本来进行分析检测，并已建立了多种赤眼蜂的物种特异性PCR鉴定方法。

如，李正西和沈佐锐(2001)通过对多种赤眼蜂ITS2序列的比对，设计了松毛虫赤眼蜂T.dendrolimi、玉米螟赤眼蜂T.ostriniae两种赤眼蜂的物种特异性引物。党向利(2003)进一步通过ITS2序列的分析比较，设计了松毛虫赤眼蜂T.dendrolimi等4种赤眼蜂的物种特异性引物。耿金虎等(2004)也基于螟黄赤眼蜂T.chilonis的ITS2序列设计了该赤眼蜂的物种特异性引物。类似地，付海滨(2006)基于线粒体Cytb基因设计了甘蓝夜蛾赤眼蜂T.brassicae等4种赤眼蜂的物种特异性引物，实现了基于Cytb对4赤眼蜂的物种特异性PCR分子鉴定。

此外，还可以将多个分子标记的扩增引物混合在同一PCR反应体系内，即多重PCR(Multiplex-PCR)(Gariepyetal., 2007)。多重PCR可高效地同时进行多个分子标记的扩增，节省成本，经济便捷。多重PCR还可以确保至少一条条带的成功扩增，从而避免在常规PCR中常见的假阴性对结果判断的干扰(Dangetal., 2005)。然而，多重PCR无疑对引物设计、PCR条件优化等要求更高，如需要考虑到多对引物的退火温度、不同引物间的竞争性结合等。Dang等(2005)根据37种赤眼蜂的序列比对，设计了拟澳洲赤眼蜂T.confusum和松毛虫赤眼蜂T.dendrolimi的ITS2物种特异性引物，并加入ITS1的通用引物作为PCR成功与否的指标，从而避免假阴性对结果判断的干扰。Davies等(2006)也设计了多对澳洲赤眼蜂T.australicum和短管赤眼蜂T.pretiosum的物种特异性引物，并采用多重PCR方法加以鉴定区分。

2.4 HRM

高分辨率熔解曲线分析(以下简称HRM)是基于实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，以下简称qPCR)技术发展的一项低成本、高通量、高灵敏度、操作简单的分子检测技术，已被成功应用于物种鉴定、基因分型和甲基化分析等诸多领域(Guttmannetal., 1977; Vossenetal., 2009)。该方法将荧光染料结合到双链PCR扩增产物中，染料只有在与PCR产物结合时才会发出明亮的荧光。因此，在PCR之后，测量反应荧光的同时升高扩增子的温度导致产生序列特异性熔解曲线，通过熔解曲线形状的差异来区分扩增片段间微小的序列差异(Vossenetal., 2009)。利用HMR对赤眼蜂的分子鉴定尚处于起步阶段，相关报道较少。于超(2017)采用HRM分析技术获得3种赤眼蜂COI基因的标准化熔解曲线，成功将松毛虫赤眼蜂T.dendrolimi等3种赤眼蜂鉴定区分开来。进一步，Rugman-Jones等(2017)采用罗氏的Rotor-Gene RG-3000 qPCR仪器，建立了无需DNA提取的HRM鉴定方法，并成功将T.platneri与田间存有的其他4种赤眼蜂区分开来。

相较RAPD、PCR-RFLP、物种特异性PCR等方法，HRM无需PCR后的凝胶电泳，更加快捷(Vossenetal., 2009; 李潇和卢瑶, 2010)。且一次性可同时完成96或384个样本的检测分析，具有较高通量。成本上，HRM只需在常规PCR基础上增加饱和荧光染料，不需要设计特异性探针，成本也相对低廉。另，检测完的样品还可以用于其他的检测，如后续的电泳、测序等一系列操作。然而，HRM对温控的一致性有非常高的要求，需要特殊的仪器支持，而常规qPCR仪往往难以胜任(李潇和卢瑶, 2010)。

2.5 测序比对

虽然，上述的方法均可以区别鉴定部分赤眼蜂物种，但都缺乏系统性，仅局限在部分地区展开研究，难以建立一个全面的检索体系。如，PCR-RFLP所采用的限制性内切酶各不相同，各研究间缺乏一定的比较性。而测序比对是指对特定的DNA序列进行测序，再与已知的序列进行比对，从而鉴定所测序的物种(Gariepyetal., 2007)。该方法可以直接提供分子标记的序列信息，所积累的数据可以在种间、种内等多各个层次展开研究，应用于物种鉴定、系统发育关系构建、群体多样性分析等多诸多方面(Stoeckle & Hebert, 2008; Cameron, 2014)。

Orrego等(1993)利用PCR扩增并测序了短管赤眼蜂T.pretiosum和松毛虫赤眼蜂T.dendrolimi的ITS1序列，之后赤眼蜂的相关分子标记的序列信息不断积累完善。截至2019年11月，生命条形码数据库系统(Barcode of Life Data Systems, BOLD，www.boldsystems.org)已有来自37个国家2 700多条COI序列，覆盖30个赤眼蜂的命名种；在NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库中，已积累有72个赤眼蜂命名种的ITS2序列。随着测序成本的不断下降，测序比对的方法无疑在赤眼蜂的分子鉴定中起到越来越重要的作用。Triapitsyn(2015)甚至提出，赤眼蜂新种的发表需上传其多个分子标记的序列。

然而，相较于PCR-RFLP、HRM等方法，测序的成本仍相对较高，周期相对较长。此外，值得注意的是，现有数据库中已上传序列可能存在赤眼蜂物种的错误鉴定。如，在生命条形码数据库系统中，BOLD ∶AAD6262由一条标记为食胚赤眼蜂T.embryophagum的COI序列与其他44条甘蓝夜蛾赤眼蜂T.brassicae序列聚类在一起，提示潜在的物种鉴定错误。在NCBI数据库中，ITS2序列AF453568和AF453569所标记物种为T.maidis，但后来发现其正确物种应为广赤眼蜂T.evanescens(Murthyetal., 2013)。另，Hua等(2018)通过对8种赤眼蜂、16个地理种群的COI序列构建进化树分析，也提示螟黄赤眼蜂T.chilonis来自印度种群的COI序列(KU575095)可能存在物种的错误鉴定。

3 总结与展望

赤眼蜂的分子鉴定相较于传统鉴定具有十分突出的优点，解决了之前赤眼蜂形态学鉴定中的一些难点，如雄蜂以外的发育阶段、近缘种、孤雌品系的鉴定等(Stouthamer, 2006)。然而，赤眼蜂的鉴定还远无法做到完全依赖于分子鉴定，以后也不可能完全抛弃经典的形态学鉴定。另外，所有可靠的分子鉴定方法的研究和开发，都必须建立在正确形态鉴定的基础上(党向利, 2003; Stouthamer, 2006; Huaetal., 2018)。

随着组学技术的普及，赤眼蜂越来越多的组学信息得到了解析。目前已经有赤眼蜂属的1个基因组(Lindseyetal., 2018)、3个线粒体基因组(陈龙, 2016; Chenetal., 2018; Shenetal., 2019)及多个转录组发表(Zhangetal., 2016; Wuetal., 2017; Kerimaetal., 2018)。大规模的比较组学分析使得全面、系统地筛选、评估新型分子标记成为可能。随着高通量测序成本的不断下降，全基因组测序可能成为未来常用的DNA多态性检测手段。理论上，基于广泛深入的表型-基因型关系的研究，全基因组测序不仅可以准确地鉴定蜂种，还可以预测赤眼蜂的重要农业性状，如寄生力、抗药性等。

此外，新技术的不断涌现，如等温扩增技术(Isothermal Amplification)、基于CRISPR/Cas的分子检测技术、单分子测序技术、微流控芯片等技术的发展，也为今后赤眼蜂分子鉴定提供了新的思路。以重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)等为代表的等温扩增技术的应用，可以摆脱分子鉴定对PCR仪器的依赖(Piepenburgetal., 2006)。而基于CRISPR/Cas的分子检测技术使低成本、便捷、灵敏、特异的分子检测技术成为可能(Chertow, 2018; Lietal., 2019)。其中，以代表性的SHERLOCK(Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter Unlocking)技术所生产的试纸，其灵敏度可达单分子水平，可以区分不同的病毒亚型(Myhrvoldetal., 2018)，而将CRISPR/dCas9耦合在石墨烯膜上，可把特定DNA分子的检测转化为电信号，从而达到准确、快速的鉴定(Hajianetal., 2019)。这些技术都有可能应用于赤眼蜂的鉴定。

也许不远的将来，随着新分子标记的发现、新技术的发展，更便捷、高效的赤眼蜂分子鉴定方法会不断涌现。而检测准确、操作便捷、成本低廉一直是赤眼蜂鉴定在规模化繁蜂、释放中的迫切需求，也是赤眼蜂分子鉴定研究的不懈追求。不论现在还是将来，赤眼蜂分子鉴定无疑都是赤眼蜂研究和应用的重要工具，为挖掘赤眼蜂资源提供技术支撑。

致谢：感谢新疆大学胡红英教授为本文初稿提出宝贵意见；感谢审稿专家在投稿过程中提出的建设性意见。