养心氏片对动脉粥样硬化模型小鼠的作用机制研究

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是严重危害人类健康的一类疾病，冠心病(CAD)是其主要疾病之一，冠心病又称缺血性心脏病。根据世界卫生组织(2014)报告，缺血性心脏病是全世界死亡的主要原因之一，每年700多万人死于缺血性心脏病[1]。目前，中医药治疗冠心病的研究取得了良好的疗效。多项临床实验证明，养心氏片(YXS)治疗冠心病疗效较好，但其机制研究较少，本实验研究养心氏片治疗AS模型小鼠的可能作用机制，为其临床应用提供更多的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及饲料 雄性载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠40只，雄性C57BL/6J小鼠8只，均为SPF级，动物购于北京华阜康生物科技股份有限公司，动物生产许可证编号：SCXK(京)2014-0004。基础饲料：由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。高脂饲料为购于江苏美迪森生物医药有限公司的乳脂实验动物纯化饲料MD12015(21%乳脂，0.15%胆固醇)。

1.2 药物及制备 养心氏片(由青岛国风药业股份有限公司提供，薄膜衣片，批号081204)，阿托伐他汀钙片(辉瑞制药有限公司，薄膜衣片，批号H20051408)，将养心氏片或阿托伐他汀钙片研磨后溶解于蒸馏水中，配制成浓度为0.140 g/mL、0.070 g/mL、0.035 g/mL的养心氏片高、中、低剂量组及浓度为0.257 mg/mL的阿托伐他汀钙片，按动物体重给药，每10 g动物给药0.1 mL。

1.3 试剂及仪器 FastKing cDNA 第一链合成试剂盒[批号KR116，天根生化科技(北京)有限公司]；动物组织总RNA提取试剂盒[批号DP431，天根生化科技(北京)有限公司]；SuperReal荧光定量预混试剂 [批号FP205，天根生化科技(北京)有限公司]；DNA酶1[批号RT411，天根生化科技(北京)有限公司]；β-巯基乙醇(天津市江天化工技术有限公司)；紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司，型号756MC)；Veriti PCR 热循环仪(美国ABI公司，型号4375786)；荧光定量PCR仪(美国ABI公司，型号7500fast)；光学显微镜(日本Olympus公司，型号BH-2)；体视镜(德国，LEICA公司)；LEICA CM1900组织包埋机(德国Leica公司)；低速离心机(北京京立离心机有限公司，型号LDZ5-2)；引物由上海生物工程有限公司设计及合成。

1.4 动物造模及给药 8周龄雄性C57BL/6J小鼠及ApoE-/-小鼠，均饲养于天津市人民医院动物房小鼠饲养笼内，每笼2只，饲养室恒温(22±2)℃。人工光照明暗各12 h。所有小鼠在予普通饲料适应性喂养1周后，C57BL/6J小鼠继续予普通饲料喂养，ApoE-/-小鼠予高脂饲料喂养12周复制AS模型。ApoE-/-小鼠高脂饲料喂养12周后，将其随机分为模型组、养心氏片高剂量组、养心氏片中剂量组、养心氏片低剂量组、阳性对照组，每组8只。C57BL/6J小鼠8只作为正常对照组。给药方法：养心氏片高、中、低剂量组分别给予1.40 g/(kg·d)、0.70 g/(kg·d)、0.35 g/(kg·d)，相当于70 kg成人临床剂量的2倍、1倍、0.5倍的养心氏片灌胃，阳性对照组给予2.57 mg/(kg·d)阿托代他汀钙，相当于成人20 mg/d临床剂量的阿托伐他汀钙片灌胃，每日1次；模型组及正常对照组给予等量的高温灭菌蒸馏水灌胃，每日1次。灌胃时间为12周。

1.5 观察指标及方法

1.5.1 苏木素-伊红(Hematoxylin-Eosin，HE)染色及升主动脉斑块校正后斑块面积测定 灌胃12周后处死小鼠，小鼠处死后迅速打开胸腔，左心室逆行灌注液体至主动脉，钝性分离主动脉(从升主动脉至髂动脉分叉处)，自头臂干分叉处向近心端取主动脉0.3 cm(升主动脉)置于4%的多聚甲醛中固定，备做病理标本。常规石蜡包埋切片，切片厚度5 μm，采用HE染色，用Image J 软件检测血管面积及斑块面积。测量管腔面积(LA)、内弹力膜围绕面积(IELa)，计算斑块面积(PA)及校正后斑块面积。斑块面积=IELa-LA， 校正后斑块面积=PA/IELa。其余组动脉于-80 ℃冰箱保存。

1.5.2 实时荧光定量(qPCR)法检测主动脉组织各因子 检测核转录因子-κB(NF-κB)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、血管内皮细胞黏附分子-1(VCAM-1)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA的表达。采用动物组织总RNA提取试剂盒提取小鼠主动脉组织总RNA，微量分光光度计检测RNA样品纯度。然后按照反应体系进行逆转录，RT-PCR反应体系及条件按试剂盒说明书进行。以GAPDH作为内参照基因，GAPDH上游：5′-GTTACCAGGGCTGCCTTCTC-3′，GAPDH下游：5′-GATGGTGATGGGTTTCCCGT-3′；MCP-1上游： 5′-CCACTCACCTGCTGCTACTCATTC-3′，MCP-1下游：5′-CTGCTGCTGGTGATCCTCTTGTAG-3′；VCAM-1上游：5′-ATCTCAGGTGGCTGCACAAGTTG-3′，VCAM-1下游：5′-AGCGCACAGGTAAGAGTGTTCATC-3′；IL-6上游：5′-ACTTCCATCCAGTTGCCTTCTTGG-3′，IL-6：下游 5′-TTAAGCCTCCGACTTGTGAAGTGG-3′；TNF-α上游：5′-GCGACG TGGAACTGGCAGAAG-3′，TNF-α下游： 5′-GCCACAAGCAGGAATGAGAAGAGG-3′；NF-κB上游：5′-GACACGACAGAATCCTCAGCATCC-3′，NF-κB下游：5′-CCACCAGCA GCAGCAGACATG-3′；PCR反应条件：95 ℃，10 min； 95 ℃，15 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s；循环40次。然后进行20 min的产物溶解程序，作溶解的曲线分析，将不同浓度的定量模板对数和相应的CT值作图。结果判定：△CT= CT- CTGAPDH。用各实验组样本的△CT减去正常对照组样本的△CT，得到△△CT，以2-△△CT表示mRNA的相对表达量。

2 结 果

2.1 各组小鼠升主动脉HE染色结果 正常对照组小鼠动脉管腔未见明显改变，管壁外、中、内膜3层结构明显，内膜光滑无增厚，内皮细胞完整连续，内膜下无沉积的脂质及斑块形成，弹力板完整，中膜血管平滑肌细胞长呈梭形，整齐排列；模型组小鼠主动脉壁有明显的斑块形成，管腔狭窄，内皮细胞缺失或不完整，内膜表面不光滑，斑块内可见大量泡沫细胞浸润，脂质丰富，胆固醇结晶形成，有时可见斑块破裂、出血、血栓形成。各药物治疗组主动脉亦可见内膜增厚、斑块形成，但与模型组相比较，斑块病变减轻，斑块面积减小，泡沫细胞和脂质减少，胆固醇结晶减少。详见图1。

图1 各组小鼠升主动脉HE染色结果

2.2 各组小鼠升主动脉斑块校正后斑块面积比较 各给药组与模型组相比，升主动脉斑块校正后斑块面积比较差异有统计学意义(P<0.05)，与养心氏片高剂量组相比，养心氏片低剂量组与养心氏片中剂量组升主动脉斑块校正后斑块面积差异有统计学意义(P<0.05)，且升主动脉斑块校正后斑块面积随养心氏片剂量水平的上升而逐渐下降，呈量效关系，而养心氏片高剂量组与阳性对照组升主动脉斑块校正后斑块面积相比差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

2.3 各组小鼠主动脉NF-κB信号通路相关因子表达水平比较 与正常对照组小鼠相比，模型组及各给药组小鼠主动脉NF-κB、MCP-1、VCAM-1、TNF-α、IL-6表达水平明显上调(P<0.05)。各给药组小鼠主动脉NF-κB、MCP-1、VCAM-1、TNF-α、IL-6表达水平低于模型组小鼠，差异有统计学意义(P<0.05)。养心氏片高剂量组小鼠主动脉NF-κB、MCP-1、VCAM-1、TNF-α、IL-6表达水平低于养心氏片低剂量组及养心氏片中剂量组，差异具有统计学意义(P<0.05)，且呈剂量依赖性，即小鼠主动脉NF-κB、MCP-1、VCAM-1、TNF-α、IL-6表达水平随养心氏片给药剂量的增加而下降。养心氏片高剂量组小鼠主动脉NF-κB、MCP-1、VCAM-1、TNF-α、IL-6表达水平与阳性对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

表1 各组小鼠升主动脉斑块校正后斑块面积水平(±s) mm2

与模型组比较，1)P<0.05；与养心氏片高剂量组比较，2)P<0.05

表2 各组小鼠主动脉NF-κB信号通路相关因子表达水平比较(±s)

1)与正常对照组比较，P<0.05；2)与模型组比较，P<0.05；3)与养心氏片高剂量组相比，P<0.05

3 讨 论

AS的治疗一直是研究的热点，AS是一种由多种因素导致的慢性血管性炎症性疾病，目前临床上治疗AS主要采用介入治疗或降脂治疗，介入治疗风险较大，而降脂药长期服用易损伤肝功能，停药后血脂水平极易反弹，甚至比未用降脂药之前血脂水平更高，导致很多病人不能长期耐受。中医诊治具有辨证论治及整体治疗的双重特点，中药毒副作用小，长期服用无明显不适，耐受性强，其作用多靶点、多途径，可根据病人的情况调整用药，较西药用药更加灵活，可作为治疗AS的一种长期有效的疗法。

多项临床试验证明，养心氏片对冠心病具有良好疗效，养心氏片源于著名老中医周次清的临床经验方，由人参、黄芪 、丹参、醋延胡索等13味药物组成，具有益气活血、化瘀止痛的功效。以“养心理论”为指导思想所创造的养心氏片，围绕着“心主血、心主脉、心藏神”的生理功能，体现着养心氏片以补为养、以通为养、以安为养的学术思想，主治冠心病气虚血瘀证。统计显示：冠心病的13种中医证型中气虚血瘀证占13.85%，排名第三，而在脑梗死13种中医证型中，气虚血瘀证占19.42%，排名第二[2]。流行病学调查显示：长春地区肥胖合并颈动脉粥样硬化的四大主要证型之一是气虚血瘀证[3]。由此可见AS常见证型是气虚血瘀证。

近年来有大量的研究关于NF-κB活性抑制药延缓AS病程的报道，故NF-κB信号通路在AS进程中起关键作用[4]。研究发现，从早期的脂质氧化、内皮细胞受损，到AS斑块的形成，始终伴随着炎症反应，而在AS形成中，参与炎症反应的很多重要炎症因子都是 NF-κB 的靶基因，NF-κB信号通路调控了这些炎症因子的转录[5]。典型的NF-κB是由多肽链p50和p65亚基组成，当细胞处于静息状态时，NF-κB与抑制蛋白(IκB)结合形成三聚体，其在细胞质中以无活性的形式存在[6]，当细胞受到外界信号刺激时，IκB发生磷酸化并降解，此时NF-κB逃离IκB的控制而被激活，NF-κB进入细胞核内并与靶基因相应部位结合，开启相关基因的转录[7-8]。在 AS中，NF-κB 是黏附分子、趋化因子、细胞因子、炎症因子以及生长因子的重要调控因子，可促进斑块的形成与发展，最终导致斑块破裂引起冠心病以及脑卒中等危重心血管疾病的发生[9-10]。NF-κB是一类具有调控基因转录作用的因子，促进炎症反应的发生是通过激活多种细胞因子表达来实现，目前已知细胞黏附分子ICAM-1和VCAM-1的表达受到转录因子的调控[11]。TNF-α通过正负反馈激活NF-κB，引起炎症持续发生导致AS。TNF-α以通过激活 NF-κB 信号途径，促使大量的炎症因子与黏附分子在内皮细胞合成，这些因子可以激活或者募集各类炎症细胞，导致内皮细胞凋亡，加速血管氧化、炎症反应及血栓形成[12]。VCAM-1是免疫球蛋白超家族的成员，在机体受到致炎因子如TNF-α、IL-6的刺激下，VCAM-1的表达会增加，参与淋巴细胞的活化与迁移，并在炎症过程中起重要作用[13]。NF-κB可调控TNF-α、IL-6、VCAM-1、MCP-1的表达，一方面，TNF-α、IL-6可促进内皮细胞表达VCAM-1，可诱导单核细胞黏附至血管内皮，衍变成为泡沫细胞，另一方面，TNF-α、IL-6促进巨噬细胞表达MCP-1，可趋化单核细胞迁移入动脉内皮下层，然后巨噬细胞通过摄取氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)形成泡沫细胞，加速动脉粥样斑块的形成，更重要的是，TNF-α、IL-6可进一步活化NF-κB，促进TNF-α、IL-6、MCP-1、VCAM-1的表达，形成一个恶性循环，加剧AS的发展[4]。

本实验结果证明，养心氏片可降低主动脉NF-κB信号通路下游相关因子TNF-α、IL-6、VCAM-1、MCP-1的表达。表明养心氏片可通过调节NF-κB信号通路降低炎症反应，减少趋化单核细胞在受损血管内皮处转化为巨噬细胞，减缓泡沫细胞的形成，发挥AS的作用，而养心氏片高剂量组对NF-κB信号通路相关因子的调节效果与阿托伐他汀无明显差异。提示养心氏可有效改善AS，其机制可能与降低AS小鼠升主动脉斑块校正后斑块面积及下调主动脉NF-κB信号通路相关因子 mRNA的表达有关。