抗菌肽杀菌效果、机制研究方法进展

时志琪 连凯琪 林正丹 马园园

（安阳工学院生物与食品工程学院/河南省动物疫病防控与营养免疫院士工作站/河南省兽用生物制品研发与应用国际联合实验室 455000）

抗菌肽是机体内抵御体外病原感染时生成的一类小分子物质，构成生物体内的天然保护屏障，可以通过直接杀伤病原微生物或通过调节体内免疫系统抵御入侵，对多种病原微生物具有抑制作用，如病毒、真菌、细菌、寄生虫等，也能杀死变异的肿瘤细胞等[1]。抗菌肽的来源十分广泛，包括昆虫、哺乳动物、两栖动物、鱼类、软体动物和甲壳类动物及植物等[2]。近些年，抗生素不科学地使用造成了很多严重的问题，寻找抗生素替代品迫在眉睫。因抗菌肽的抗菌谱广、种类多、抗菌机理独特、不容易产生耐药性，通常被认为是很具应用前景的抗生素替代品[3]。本文基于前人的研究，对抗菌肽杀菌效果、最小抑菌浓度、杀菌动力学曲线及杀菌机制的研究方法展开综述，为以后抗菌肽的研究做铺垫。

1 抗菌肽抑菌效果研究方法

1.1 滤纸片法

滤纸片法是做细菌药敏试验的常用方法，研究者借鉴该方法对抗菌肽的抑菌效果进行研究。潘晓倩等[4]用滤纸片法研究不同浓度抗菌肽Nisin 对3 种不同细菌的抑菌效果。滤纸片法操作简单，结果直观，但无法控制滤纸片对抗菌肽的吸附量（即无法做到对实验的定量），重复性较差。

1.2 牛津杯法

牛津杯法是国内外测定抗菌肽效价的通用方法，但若是使用方法或者操作不当，容易出现抑菌圈不明显甚至无抑菌圈等现象。潘晓倩等[4]利用牛津杯法对抗菌肽Nisin 对不同细菌的抑菌活力进行测定。此法可以做到对加入的抗菌肽定量，但需要的剂量较大，且操作较为复杂，在放置牛津杯时力度不易掌控，容易滑动甚至倒翻，需要操作者有娴熟的操作技巧和经验。

1.3 打孔法

杀菌效果的研究方法中打孔法较为常用。该法操作简单，重复性好，且可以做到定量，对操作者的要求也相对较低，是杀菌效果研究方法中较为理想的一种，因此，在抗菌肽抑菌效果研究中经常被使用。王利锋等[5]曾用打孔法研究大鲵皮肤分泌液中抗菌肽对不同细菌的抑菌效果。

1.4 活菌计数法

活菌计数法是取一定量经抗菌肽处理后的菌液进行涂板，培养一定时间后记录平板上的活菌数量。姜太玲等[6]用活菌计数法研究花椒籽蛋白抗菌肽的抑菌效果。这一方法最大的不足之处就是工作量较大，每一个浓度的涂板至少要重复3 次。但其操作简单，结果直观准确，可以很好地判断抗菌肽的杀菌效果。

2 抗菌肽最小抑菌浓度检测方法

2.1 刃天青显色法

利用刃天青具有氧化还原这一特性，对抗菌肽的最小抑菌浓度进行测定。即将刃天青加入无菌液体中呈原本的蓝色，加入有菌的液体中会变色呈红色。钟亨任[7]利用刃天青显色法鉴定了抗菌肽Brevinin-GR23 对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度。利用该方法鉴定最小抑菌浓度时，可以在培养结束后先目测浑浊度，对其抑菌效果进行初步判断，然后再加刃天青显色，使结果更加准确可靠。但操作一定要十分严谨，做到完全定量，否则容易出现重复试验结果不一致的问题。

2.2 测吸光度法

抗菌肽的最小抑菌浓度也可以通过测吸光度来判断，钟亨任[7]在做刃天青的同时也测了吸光值。其结果与刃天青显色法结果一致。但影响吸光值的因素有很多，这些因素会造成结果不准确，因此，该方法判定最小抑菌浓度的可信度较低，仅可作为参考。

3 杀菌动力学曲线研究方法

3.1 测OD 值法

对抗菌肽杀菌动力学曲线的研究，赵雪芹[8]曾采用测OD值法，研究沙门氏菌经不同浓度抗菌肽处理后，在不同培养时间下的存活量，结果显示，该抗菌肽对沙门氏菌有很好的杀菌效果，且呈剂量依赖性。该方法操作简单，工作量小，耗时短，但影响OD 值的因素较多，得出的数据误差较大，可靠性低。

3.2 平板计数法

张炜[9]等采用平板计数法研究抗菌肽对大肠杆菌的杀菌动力学曲线，结果表明该，抗菌肽对大肠杆菌有明显的抑制作用，可以很好地杀死大肠杆菌，且呈时间依赖性。在利用平板计数法测定抗菌肽的杀菌动力学曲线时，每一个浓度涂板至少需要重复3 次，工作量大大增加。与测OD 值法相比，虽然平板计数的工作量较大，但其结果更直观、更准确。

4 抗菌肽抑菌机制的研究方法

抗菌肽的抑菌机制有很多，可通过改变细胞膜的通透性，破坏细胞膜的完整性；与DNA 作用，影响蛋白质的合成等来达到抑菌作用。研究者通过荧光染色、电镜观察、凝胶阻滞电泳等方法对抗菌肽的抑菌机制进行研究。

4.1 荧光染色法

抗菌肽可以增加细胞膜的通透性，使细胞膜的完整性受损而达到杀菌作用。碘化丙啶（PI）作为一种荧光显色剂，可以穿过破损的细胞膜对细菌染色。Qinghua Zhang 等[10]通过测定细菌对PI 的吸收来确定细菌膜通透性的改变。该方法比较直观生动地反应细胞膜通透性的变化，在研究抗菌肽对细菌细胞膜的研究中经常被采用。

4.2 电镜观察法

用电子显微镜观察经抗菌肽处理的细菌能直观地看出抗菌肽对细菌形态结构的作用。谢海伟等[11]使用电镜观察合成抗菌肽对大肠杆菌F41 的作用，结果显示，细菌细胞的形态产生了很明显的变化；冯兴军等[12]通过透射电镜观察经鸭抗菌肽处理后的大肠杆菌的结构形态。该方法最直接显示抗菌肽对细胞的杀伤效果，通常作为抗菌肽杀菌的重要数据，但需要较高的试验仪器，透射电镜和扫描电镜。

4.3 凝胶阻滞电泳法

抗菌肽还可以通过与DNA 的作用来发挥其抑菌效果。裴志花[13]检测家蝇抗菌肽MDAP-2 与DNA 的结合能力。吴希[14]研究表明，抗菌肽能与真菌的DNA 和RNA 结合。该方法也是研究抗菌肽抑制细菌的一种分子检测方法，通常被作为实验室检测抗菌肽是否作用于细菌DNA 的检测手段。

5 小结

随着抗生素耐药菌株的出现及对环境污染的日益严重，学者们越来越重视抗菌肽方面的研究。抗菌肽抑菌效果和抑菌机制的研究方法很多，笔者在抗菌肽现有研究方法的基础上进行归纳总结，比较研究了抗菌肽抑菌作用更合适的方法。本文简要概述抗菌肽杀菌效果、最小抑菌浓度、杀菌动力学曲线及杀菌机制的研究方法，通过比较前人研究基础推测，杀菌效果的研究方法中打孔法最优；MIC 测定最优方法为刃天青显色法，而杀菌动力学曲线使用平板计数法最为准确；对于杀菌机制的研究，不同的杀菌机制需要不同的研究方法。当然，随着不断地探索和科学技术的进步，也许会有更好的研究方法可以更全面、深入地研究抗菌肽。