环状RNA 的生物学特性及其对牙源性间充质干细胞成骨分化的影响*

张 硕 刘洪臣

环状RNA(circular RNAs,circRNAs)是一类特殊的内源性非编码RNA，广泛存在于真核生物、原核生物、病毒及古生菌中。CircRNAs 不同于线性RNA，其3’和5’末端相连接，形成共价闭合环状结构，不易被核酸外切酶降解，从而更加稳定。最初，circRNAs 被认为是异常剪接形成的无价值的副产物，但随着生物信息分析技术的发展及高通量测序技术的成熟和应用，circRNAs 重要的生物学功能被不断探索和揭示。CircRNAs 可参与细胞生命活动、胚胎发育、神经发育及人类多种疾病的发生发展，并且是肿瘤、心血管疾病、神经系统疾病和糖尿病等疾病早期诊断的理想生物标志物[1]。

骨缺损在口腔颌面缺损中很常见，可由牙周炎骨吸收、无牙颌剩余牙槽嵴吸收以及由创伤、炎症、肿瘤等造成，对患者的外形、功能和心理造成严重影响。随着骨组织工程的不断发展，利用组织工程骨修复颌面部骨缺损，从而恢复患者的美观和功能已成为当今口腔医学领域的研究热点。成骨细胞作为骨组织工程的种子细胞，可由牙源性、骨髓源性和脂肪源性等多种间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)分化而来。其中，牙源性间充质干细胞(dental mesenchymal stem cells,DMSCs)自我更新能力强、免疫原性低且具有多向分化潜能，尤其是骨向分化能力，使其在骨组织工程中具有广泛应用前景[2]。

DMSCs 成骨分化能力的正常发挥是修复缺损骨组织效果的保障。目前研究表明，circRNAs 可以通过多种分子和信号通路调控DMSCs 成骨分化，进而影响骨代谢过程[3]。因此，对circRNAs的生物学特性进行表征并综述其对DMSCs 成骨分化的作用机制研究，有助于从新的角度了解骨再生过程，同时为寻找治疗口腔颌面部骨缺损的潜在有效靶点提供新的途径和理论基础。

1.circRNAs 概述

1.1 circRNAs 的生物合成 根据circRNAs 在基因组中的来源及构成序列不同，可分为：外显子环状RNA(exon circRNA,EcircRNA)、外显子-内含子环状RNA(exon-intron circRNA,EIcircRNA)和内含子环状RNA(circular intronic RNA,ciRNA)。它们都源自于同一亲本基因，在顺式及反式作用元件的调控下，特异性序列剪接环化而形成，属于基因内circRNAs[4]。若circRNAs 为不同的亲本基因融合后产生，如非小细胞肺癌患者血清中的F-circEA由EML4-ALK 基因融合产生，则称为融合基因来源的环状RNA(fusion-circRNA,f-circRNA)[5]。目前认为circRNAs 合成的驱动方式主要有三种：索套驱动环化或外显子跳跃、内含子配对驱动环化或直接反向剪接、RNA 结合蛋白(RNA-binding proteins,RBPs)驱动环化[6]。

1.2 circRNAs 的特点 circRNAs 具有稳定性高、进化保守、组织特异性强等特点。与线性RNA 不同，circRNAs 不具有5’端帽子和3’端poly(A)尾巴，其闭合环状结构可以抵抗核酸外切酶的降解作用，因此稳定性更高。此外，研究表明circRNAs 在不同物种间存在较多相似的序列，这种进化的相对保守性使得在猪、小鼠等动物模型中鉴定出的多种circRNAs 生物标志物在人类临床也具有应用潜力[7]。CircRNAs 在表达上具有组织特异性，例如，源于Rmst 和Klhl2 的circRNAs 在小鼠大脑中大量富集，但在肺和肝组织中无表达[8]；在肿瘤组织和正常组织中circRNAs 表达差异显著，且不同肿瘤细胞的circRNAs 表达也呈现种类和含量的差异，如hsa_circ_002059 在胃癌组织中低表达[9]，hsa_circ_0001649 在肝癌细胞中显著低表达[10]。

1.3 circRNAs 的功能

1.3.1 作为miRNA“海绵” circRNAs 上存在miRNA 的结合位点，即miRNA 反应原件(miRNA response elements,MREs)，可以竞争性结合miRNA，抑制其与靶mRNA 结合，调控靶基因表达，起到miRNA“海绵”的作用[11]。研究发现，circRNA_33287 可以通过靶向结合miR-214-3p 分子的3’-UTR，消除miR-214-3p 对RUNX3 的抑制作用，上调RUNX3 的表达[12]；hsa_circ_0068871 可作为miR-181a-5p“海绵”，消除miR-181a-5p 对FGFR3 的抑制，从而激活STAT3 信号[13]。此外，一种circRNA 的多个结合位点可螯合多种miRNA 分子，影响其靶标的表达，如circHIPK3 可以通过18 个潜在的结合位点，结合9 种miRNAs，调控人类细胞增殖[14]。

1.3.2 与RBPs 作用 CircRNAs 上可存在一个或多个RBPs 的结合位点。CircFoxo3 通过结合周期蛋白依赖性激酶2(cyclin dependent kinases 2,CDK2)及周期蛋白依赖性激酶抑制剂1(cyclin dependent kinase inhibitor 1,p21)形成复合体，抑制CDK2 功能，进而阻断细胞周期[15]。CircPABPN1可以结合HuR 蛋白，阻碍HuR 蛋白与线性转录本PABPN1 的结合，从而下调PABPN1 的表达水平[16]。另有研究发现，circRNAs 经过N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)修饰后，能够以HRSP12 依赖的方式结合m6A 识别蛋白YTHDF2，介导RNase P/MRP 复合物降解circRNAs[17]。

1.3.3 参与调控基因的表达 circRNAs 能够调控RNA 转录和选择性剪接，进而调控宿主基因的表达。CircRNAs 多数位于细胞质，而EIcircRNAs和ciRNAs 位于细胞核[18]。研究发现，一些核内EIcircRNAs 可以在转录水平起到调控作用，如circ-EIF3J 和circ-PAIP2 能够结合U1 小核核糖核蛋白(U1small nuclear ribonucleoprotein,U1snRNP)，形成的复合物进一步募集RNA 聚合酶Ⅱ(Pol Ⅱ)，正调控亲本基因的表达[18]；另外，ciRNAs 也可以调控基因转录，如ci-ankrd52 和ci-sirt7 在细胞核内结合Pol Ⅱ并作用于亲本基因的启动子，调控其转录过程[19]。

此外，circRNAs 在剪接水平上也可以调节基因的表达。通过反向剪接模式形成的EcircRNAs，竞争性减少了由线性拼接而产生的线性RNA 的表达[20]。例如，circMbl 的合成依赖剪接因子MBL的第二个外显子序列环化，而circMbl 中存在MBL的结合位点，影响了MBL 前体mRNA 的剪接，调控线性基因的表达[20]。

1.3.4 编码蛋白质 circRNAs 一般被认为是一种内源性非编码RNA，但越来越多研究发现，circRNAs 具有编码蛋白质的功能。Circ-ZNF609经过内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)驱动后，能够直接翻译小鼠成肌细胞的蛋白质，参与成肌分化过程[21]。另外，circRNAs 经过m6A 甲基化修饰后，能够识别并结合YTHDF3蛋白，进而通过螯合eIF4G2 蛋白及一些翻译起始因子，驱动自身的翻译，表达蛋白质[22]。CircRNAs的编码蛋白质功能具有重要的临床疾病治疗意义，如circ-FBXW7 能够翻译FBXW7-185aa 蛋白，与FBXW7 蛋白协同作用，下调c-myc 蛋白的表达，抑制恶性胶质瘤的发生[23]。

1.3.5 其他功能 circRNAs 可广泛、稳定地存在于细胞外泌体中，使得其可作为癌症诊断的生物标记物，如在结肠癌患者和健康人的血清外泌体中，可筛查出多种表达量具有明显差异的circRNAs[24]。CircRNAs 还能够通过反转录的方式衍生出假基因，对细菌、小鼠、人类等生物体的基因组结构产生影响[25]，例如在小鼠基因组中可鉴别到来源于circRFWD2、circDIAP3 和circSATB1 的假基因，其中circRFWD2 可衍生出至少33 个假基因[26]。此外，有研究发现circRNAs 具有调节mRNA 稳定性的功能，如小鼠巨噬细胞中的circ-RasGEF1B能够增强TLR4/LPS 通路中mRNA ICAM-1 的稳定性[27]。

2.circRNAs 对DMSCs 成骨分化的影响

DMSCs 来源广泛，包含多种干细胞参与牙的形成，包括牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)、牙滤泡细胞(dental follicle cells,DFCs)、根尖乳头干细胞(stem cells of apical papilla,SCAPs)、牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)、脱落乳牙干细胞(stem cells of human exfoliated deciduous teeth,SHEDs)、牙胚细胞(tooth germ stem cells,TGSCs)、牙槽骨间充质干细胞(alveolar bone mesenchymal stem cells,ABMSCs)和牙龈间充质干细胞(gingival mesenchymal stem cells,GMSCs)。DMSCs 可分化为成骨细胞，用于修复受损的骨组织[28]，因此其在骨组织工程的应用受到广泛关注，对DMSCs 成骨机制的研究也成为热点。目前有研究发现，circRNAs 可以调控DMSCs骨向分化，在骨代谢进程中发挥重要作用[3]。

2.1 调控PDLSCs 成骨分化 PDLSCs 来源于牙周膜，具有形成牙骨质和骨组织的能力，可应用于骨缺损的修复。PDLSCs 经体外诱导可形成矿化结节，可检测到碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和骨唾液蛋白(bonesialoprotein,BSP)表达[29]；在小型猪的牙周炎模型中，应用自体PDLSCs 与复合生物支架结合后植入牙槽骨缺损处，可观察到有大量新骨生成[30]；PDLSCs 分别与骨及粘骨膜组织工程支架材料复合后体内移植,可显著增高犬的牙槽嵴高度，实现牙槽嵴的增高重建[31]。

Zheng 等[32]诱导PDLSCs 成骨分化3、7、14天，检测不同阶段差异表达的circRNAs，结果显示共有52 个circRNAs 持续发生改变。进而分析了miRNA 转录组并构建circRNA-miRNA-mRNA相互作用网络，发现其中一些miRNAs 已被证明可以调节成骨过程，比如miR-204 靶向作用于Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor-2,RUNX2)抑制成骨并促进MSCs 的脂肪生成，miR-2816 通过过表达RUNX2 促进成骨细胞分化。因此，调控这些miRNAs 的circRNAs，如circNOTCH3和circCD59，可能在PDLSCs 成骨分化过程中发挥重要作用。

Gu 等[33]对PDLSCs 成骨诱导7 天，鉴定差异表达的circRNAs 并构建circRNA-miRNA-mRNA网络，预测这些mRNAs 可能显著参与成骨细胞分化、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路、Wnt 通路和调控干细胞多能性的信号通路。其中，circRNA BANP 和circRNA ITCH 可能与成骨相关的miR-34a 和miR-146a 相互作用，并分别通过MAPK 通路中的关键基因DUSP1、FAS、RAC1 和PDGFRA、TGFBR2、MYC 调控PDLSCs 成骨分化。然而，它们的确切调节机制仍有待研究。

Li 等[34]研究了circRNA CDR1as 和miR-7 在PDLSCs 成骨分化中的潜在作用，发现CDR1as 在成骨分化过程中显著上调，而miR-7 则显著下调。敲低CDR1as 和过表达miR-7 会抑制ALP 活性、茜素红S 染色和成骨基因的表达。此外，发现成骨相关基因GDF5 的3’-UTR 具有miR-7 的结合位点，敲低GDF5 可以部分逆转miR-7 抑制剂对成骨细胞分化的影响。并且CDR1as 或GDF5 的下调会抑制Smad1/5/8 和p38 MAPK 的磷酸化，miR-7 的上调会降低磷酸化Smad1/5/8 和p38 MAPK 的水平。进一步体内实验显示CDR1as 敲低会导致骨形成减少。因此，认为CDR1as 通过下调miR-7 的表达，抑制miR-7 对GDF5 的负调控作用，进一步激活pSmad1/5/8 和p38 MAPK 通路，促进PDLSCs 骨向分化。

Wang 等[35]对PDLSCs 进行机械力诱导，在其成骨分化过程中检测到2678 个差异表达的circRNAs。其中circRNA436 显著下调，且circRNA-miRNA 共表达网络显示circRNA436 与miR-107 和miR-335 存在相互作用关系。有研究表明miR-107 可能下调Dkk-1 抑制骨肉瘤的发生和发展，miR-335 可通过Wnt/β-catenin 通路影响MSCs 成骨分化过程[36]。因此，circRNA436可能通过Wnt/β-catenin 通路调控PDLSCs 成骨分化。此外有研究发现MAPK 通路可在机械应力作用下的成骨细胞增殖中起重要作用[37]，而显著上调的circRNA4214 可能通过MAPK 信号通路促进机械力诱导的PDLSCs 成骨分化。另外，circRNA126、circRNA3140、circRNA4045、circRNA4251 可能分别与miR-101、miR-21、miR-335、miR-107相互作用，调控机械力诱导的PDLSCs 成骨分化。

2.2 调控DFCs 成骨分化 DFCs 是牙囊基质内未分化的细胞，在体外可诱导生成类似牙骨质和骨的结构，提示其具有分化为成牙骨质细胞和成骨细胞的潜能[38]；体内实验发现，大鼠DFCs 经过骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)2 及地塞米松刺激后，结合β-TCP 支架，移植到免疫缺陷小鼠的背部，可以观察到有新骨形成[39]。此外，从人类牙滤泡中分离出的DFCs 可分化成骨用于修复鼠颅骨缺损[40]。

Du 等[41]诱导大鼠DFCs 成骨分化28 天，筛选出266 个差异表达的circRNAs。生物信息学分析显示这些差异circRNAs 可参与MARK 和TGF-β等信号通路。并在Fgfr2 基因中发现了显著上调的circFgfr2，可能调控其下游靶标miR-133 并对BMP6 起作用。进一步实验发现，使circFgfr2 在rDFCs 中过表达会导致miR-133 表达下调及BMP6表达上调。因此认为circFgfr2 可能作为miR-133“海绵”，上调BMP6 的表达，从而在rDFCs 成骨分化过程中起到阳性调控因子的作用，但具体调控机制仍需进一步研究。

2.3 调控SCAPs 成骨分化 SCAPs 可从尚未发育完全的根尖组织中获得。研究发现，牙乳头细胞经体外培养后植入免疫缺陷大鼠体内，能够形成牙骨质-编织骨样组织，并在该结构周围观察到牙骨质-骨细胞样细胞[42]，表明其具有成牙骨质和成骨分化的潜力。另外，有体外研究发现胰岛素生长因子(insulin growth factor,IGF)-1 和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)能够促进SCAPs 骨向分化[43,44]。

Li 等[45]通过构建成骨诱导7 天的SCAPs 模型，筛选出650 个组间表达差异显著的circRNAs。GO分析显示这些差异表达的circRNAs 宿主基因主要参与生物调控以及细胞代谢过程。KEGG 分析发现这些宿主基因与MAPK 信号通路、肌动蛋白细胞骨架调节和细胞内胞吞作用等有密切的关系。并且选择10 个circRNAs、21 个miRNAs 及19 个mRNAs 构建circRNA-miRNA-mRNA 网络，提示circRNAs 可能作为竞争性内源RNA 在SCAPs成骨分化过程中发挥作用。

2.4 调控DPSCs 成骨分化 DPSCs 为牙髓来源，可在体外形成新鲜自体骨，植入免疫缺陷大鼠皮下4 周后能够改建为板层骨[46]。DPSCs 还可以复合多种支架材料，在体内外成骨，这显示了其在骨组织工程中应用的巨大潜力[47]。此外，有研究表明，DPSCs 表面存在的雌激素受体利于DPSCs 骨向分化形成骨组织[48]；在成骨诱导培养基中添加维生素K2，可以在体外促进DPSCs 成骨[49]。

Ji 等[50]发现在DPSCs 成骨诱导过程中，circRNA124534 的表达显著上调，而miR-496 下调，且二者存在结合位点。研究表明circRNA124534可以促进DPSCs 在体内外成骨分化，而过表达miR-496 逆转了circRNA124534 的成骨分化作用，敲低miR-496 则能够上调β-catenin 水平进而促进DPSCs 的成骨分化。因此证实了circRNA124534可以通过miR-496/β-catenin 通路调控DPCSs成骨分化过程。

Ji 等[51]研究显示hsa_circ_0026827 的表达在DPSCs 源性成骨细胞分化过程中显著增加，而下调其表达会抑制该过程。进一步研究发现，hsa_circ_0026827 可以作为miRNA“海绵”，结合miR-188-3p，上调miR-188-3p 的下游靶标Beclin1 和RUNX1 的表达，进而通过Beclin1 介导的自噬和RUNX1 促进DPSCs 成骨分化，即从机制上阐明了hsa_circ_0026827 的表达对体内异位骨形成所具有的重要促进作用。

3.结语

随着生物测序技术日臻成熟，越来越多circRNAs被发现，同时circRNAs 的特性、功能及与疾病的关系也在逐步被揭示。DMSCs 的成骨分化潜能在骨组织工程中具有广泛的应用前景，探讨circRNAs对DMSCs 成骨分化的调控机制有助于从多角度理解骨代谢过程，并为治疗口腔颌面部骨缺损提供潜在的靶点。目前研究表明circRNAs 可通过circRNA-miRNA-mRNA 相互作用调节DMSCs成骨分化进程。于是，可对circRNAs 进行调控，在多种分子和信号通路的参与下促进DMSCs 骨向分化，发挥其种子细胞功能，修复牙槽骨和颅面骨缺损，最终实现患者颌面部的美观与功能重建。