细胞外囊泡在缺血再灌注损伤治疗中作用的研究进展*

王 姝 韩正学

临床上我们经常见到因肿瘤切除及外伤造成的大面积组织缺损需要游离皮瓣修复的患者，游离皮瓣可以很好地恢复患者的容貌及功能。血管化的游离皮瓣移植术后皮瓣组织血运障碍、水肿及坏死等并发症时常发生，其主要原因是缺血再灌注损伤。缺血再灌注损伤(Ischemia reperfusion Injury,IRI)指在血流灌注不足到再灌注早期重新获取氧供应的过程中，组织或器官的组织损伤和病理变化的总称。研究证实缺血再灌注会导致组织产生大量的氧自由基和炎性因子等，使细胞发生凋亡或者坏死，进而造成组织损伤，引起功能障碍甚至丧失生理功能[1-3]。目前治疗此类损伤的主要方法是以减少氧自由基和炎性因子的产生为出发点，但治疗效果不明显。因此，进一步探索新的治疗方法对临床工作具有重要意义。

细胞外囊泡是细胞分泌的双层脂质膜结构的颗粒，最初被认为是细胞排出的多余物质。直到20世纪90 年代，学者们才意识到这些细胞外囊泡携带胆固醇等脂类物质，富含多种生物活性物质，参与细胞存活与凋亡、血管新生、血栓形成、炎症免疫反应等生理和病理过程[4]。细胞外囊泡主要存在于血液、淋巴液、唾液、尿液、乳汁等各种体液[5]。几乎所有的细胞都可自发产生或在一定刺激下释放细胞外囊泡[6]。因此，了解细胞外囊泡对缺血再灌注损伤的保护作用机制十分重要。本文就细胞外囊泡对缺血再灌注损伤保护作用方面的研究进行综述，以期为治疗游离皮瓣移植术后血管危象提供新思路。

1.细胞外囊泡

细胞外囊泡是细胞分泌的双层脂质膜结构的微小囊泡，实质上是一组纳米级颗粒。细胞外囊泡可分为外泌体、微囊泡、凋亡小体[7]。外泌体分子直径30～100nm，在细胞内部形成，分泌方式特殊[8]。微囊泡也称脱落囊泡或Ectosomes，分子直径100～1000nm，是直接通过出芽方式从母细胞膜表面脱落产生。凋亡小体分子直径为500～4000nm，是细胞程序性死亡或凋亡晚期释放的微粒。研究发现，胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞等多种细胞可以分泌细胞外囊泡，而细胞外囊泡在干细胞发挥促修复功能中起到重要作用[9,10]。细胞外囊泡中的外泌体和微囊泡在缺血再灌注损伤治疗中的保护作用被大量研究证实。

2.MSCs 来源细胞外囊泡在缺血再灌注损伤治疗中的作用

2.1 MSCs 来源细胞外囊泡对心脏损伤的保护作用 间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是成体干细胞的一种,由于其自我更新、多向分化、靶向迁移、免疫调控、抗瘢痕以及抗凋亡等诸多重要的生理功能，使其在组织修复和再生方面被寄予厚望[11]。骨髓间充质干细胞经低氧或低营养诱导后会分泌释放细胞外囊泡[12]。Yoshihiro 和他的团队[13]研究发现MSC 分泌的外泌体通过增强肌肉发生和血管生成促进肌肉再生，由miR-494等miRNAs 介导。有研究报道人来源骨髓间充质干细胞可能分泌外泌体，作用于缺血心肌后能够改善心室的收缩及舒张功能，其对缺血再灌注心肌的保护作用可能通过减少氧化应激以及抑制TGF-β 信号传导来实现[14]。Jose M 等[15]研究发现在所有测试的心脏缺血再灌注模型中，富含外泌体的部分具有强大的心脏保护作用，HSP70/TLR4 通路是外泌体介导心脏保护作用的关键。研究发现MSCs来源的外泌体可减少心肌纤维化，并且促进细胞增殖及血管新生，从而提升心肌干细胞的生存能力，改善心肌梗死后的心功能；该研究提出该保护机制可能和miRNA 相关，但具体机制尚不明确。有学者发现缺血再灌注发生时，具有保护作用的Nanog 蛋白和缺氧诱导因子1α 水平升高，进而上调miR-21 和miR-210，减少心肌细胞凋亡[16]。而诱导多能干细胞分泌的外泌体可保护细胞免受氧化应激损伤；进一步研究显示，诱导多能干细胞来源的外泌体中包含miR-21 和miR-210，因此推测其保护作用可能是由miR-21 和miR-210 产生[10]。

2.2 MSCs 来源细胞外囊泡对脑损伤的保护作用 Daan R 等研究间充质干细胞分泌的细胞外囊泡(MSC-EV)在早产儿缺氧缺血性脑损伤的临床前模型中的保护作用。他们通过闭塞脐带使胎儿受到短暂的全面缺氧缺血后在子宫内静脉注射MSC-EVs治疗，采用大脑电生理参数分析评估MSC-EV 的治疗效果。发现间充质干细胞分泌的细胞外囊泡通过减少总发作次数和持续时间，以及保持压力感受器反射敏感性来改善脑功能。与此同时防止髓鞘降解的倾向[17]。已有大量研究发现MSCs 等来源的外泌体对神经损伤有保护作用。缺血再灌注脑组织损伤主要通过氧化应激和炎性因子等造成，外泌体中含有抑制活性氧和炎症的物质，而且可以透过血脑屏障，可能能作为治疗脑损伤的一种新途径[18]。除了神经元细胞，中枢神经系统的其他细胞也分泌外泌体。Guitart 等[19]发现星型胶质细胞分泌的外泌体可以改善缺血条件下神经元的存活能力，这种保护作用可能是通过减少氧化应激来实现的。Song等[20]研究发现M2 小胶质细胞来源的外泌体在体外和体内被神经元所占用。M2 小胶质细胞来源的外泌体治疗减弱了缺氧-葡萄糖剥夺后神经元的凋亡。体内结果显示，M2 小胶质细胞来源的外泌体治疗可显著减少短暂脑缺血3 天后的梗死体积和减轻行为缺陷。Xiao 等[21]研究证实内皮细胞来源的外泌体部分抑制了缺血再灌注损伤诱导的细胞周期阻滞和凋亡，抑制了SH-SY5Y 神经细胞的增殖、迁移和侵袭。内皮细胞来源的外泌体直接保护神经细胞免受缺血再灌注损伤。

2.3 MSCs 来源细胞外囊泡对肾脏损伤的保护作用 Federica 等[22]的动物实验结果显示下调人MSCs 中的miRNA 后MSCs 及其分泌的细胞外囊泡的再生能力在肾脏中降低。这种效应与细胞和细胞外囊泡的miRNA 组成发生变化有关。Zhang等[23]研究发现MSC 分泌的细胞外囊泡调节肾脏的氧化应激和炎症反应。NADPH 氧化酶(NOX)-2在缺氧再灌注损伤的大鼠肾脏中表达上调，但在静脉给予MSC 分泌的细胞外囊泡的缺氧再灌注损伤的大鼠肾脏中表达未上调。这种干预不仅减轻氧化应激，而且还减少细胞凋亡和增强肾细胞增殖，表明肾受体细胞中的NOX2 的转录后调节可能涉及MSC 分泌的细胞外囊泡诱导的肾修复。Zhou 等[24]研究顺铂诱导的急性肾损伤大鼠发现人脐带间充质干细分泌的细胞外囊泡减弱了肾小管细胞的氧化应激、凋亡、坏死，减轻了肾功能障碍。肾修复效力的恢复主要依赖于富含间充质干细分泌的细胞外囊泡中的蛋白质。Faisal 研究证实MSCs 来源的外泌体对肾缺血再灌注损伤具有保护作用[25]。此外，ZOU 等[26]发现来源于人间充质干细胞的微囊泡通过抑制CX3CL1 改善大鼠肾脏缺血再灌注损伤。

3.MSCs 来源细胞外囊泡在游离皮瓣缺血再灌注损伤治疗中的保护作用

近年,随着显微外科的发展，血管吻合技术应用于游离皮瓣移植术，游离皮瓣在修复重建领域的作用越来越重要。血运障碍即血管危象是游离皮瓣移植术后最常见的并发症。延迟发现血管危象或出现更严重的血管危象，可导致游离移植组织瓣完全坏死，组织修复失败。研究发现皮瓣在移植过程中处于缺血状态，进而氧自由基释放，导致微血管内皮细胞损伤。受伤的内皮细胞进一步释放多种细胞因子，发生急性炎症反应，诱发血小板凝集。炎症反应加重，毛细血管床堵塞，持续缺氧和能量化合物耗竭使内皮细胞肿胀，血管腔闭塞。血液淤积，内皮细胞的纤溶活性丧失，因而凝血链被激活，皮瓣的微循环完全栓塞。

Bai 等[27]为了评估脂肪间充质干细胞(ADSC)的外泌体是否能在缺血再灌注损伤时保护皮瓣并诱导新生血管。通过结扎鼠左上腹下浅血管后再灌注血液，将来自正常的ADSC 外泌体和来自H2O2预处理的ADSC 外泌体注射到皮瓣中，观察外泌体在皮瓣移植体内缺血再灌注损伤中的作用。与缺血再灌注相比，外泌体在体内显著提高了皮瓣术后第5 天的存活率和毛细血管密度，降低了皮瓣的炎症反应和细胞凋亡。此外，与正常外泌体相比，H2O2预处理的ADSC 外泌体的疗效更好。来自低氧处理的人ADSCs 的外泌体具有增强脂肪移植血管生成的能力，部分是通过调节VEGF/VEGF-r 信号实现的[28]。

4.小结

囊泡分泌是细胞的基本生命过程，这些囊泡包裹了小RNA、质粒DNA、酶和神经递质等。MSCs来源的外泌体和微囊泡在缺血再灌注损伤治疗中的保护作用被学者关注。研究缺血再灌注损伤的机制，可以为治疗游离皮瓣移植术后血管危象提供新思路。随着近年来研究的不断深入，发现细胞外囊泡还在纤维化、自噬、免疫抑制及免疫激活等多方面发挥作用[29-31]。细胞外囊泡虽存在广泛，但获取细胞外囊泡的量少、纯度低，目前研究对细胞外囊泡发挥作用的具体成分及其分子机制尚不清楚，仍需要投入更多的时间和精力深入研究。