内质网应激与蛋白质错误折叠相关疾病的研究进展

张肖楠 廉姜芳

蛋白质是生命的物质基础，也是生物活动的主要承担者。蛋白质折叠是生命活动的最基本过程，蛋白质的错误折叠可以导致疾病，如阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）、2 型长QT 综合征（long QT syndrome 2，LQT2）、囊性纤维化病和糖尿病等。蛋白质稳态需要新合成蛋白质的有效折叠以及蛋白质质量的控制和降解。内质网（endoplasmic reticulum，ER）肩负着维持蛋白质稳态的使命，在生理条件下，ER 腔内分子伴侣帮助新合成的天然蛋白质的正确折叠，质量控制系统识别错误折叠的蛋白质，通过蛋白酶体、溶酶体和自噬途径降解错误折叠蛋白质[1]。许多病理生理状态和细胞环境改变会诱发内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS），包括蛋白质合成水平的提高、泛素化和蛋白酶体降解受损、自噬不足、能量不足、营养过剩或营养不足、钙水平失调或氧化还原稳态失衡、炎症反应和缺氧。大量研究表明，在蛋白质错误折叠相关疾病中可以检测到ERS，但ERS 在蛋白质错误折叠相关疾病的病理生理过程发挥的具体作用尚不完全清楚[2-5]。因此，深入研究ERS 与蛋白质错误折叠相关疾病的关系已成为分子生物学新的研究前沿。本文就ERS 与蛋白质错误折叠相关疾病的最新研究动态作一综述。

1 ERS 与未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）

ER 腔内存在帮助分泌蛋白和膜蛋白完成折叠和翻译后修饰的分子伴侣家族、辅酶和辅助因子，它们帮助蛋白质形成正确的天然构象。ER 腔中新合成的蛋白质是否能从ER 中释放主要受到多种ER 滞留信号与ER 退出信号的监测[6]。其中，ER 滞留信号可以与包被蛋白Ⅰ相互作用，防止错误折叠蛋白质退出ER 腔；ER退出信号与包被蛋白Ⅱ结合，促进蛋白质向高尔基体转运[6]。如果蛋白质未能退出ER，在ER 腔内蓄积，会诱导ERS，触发ER 跨膜蛋白肌醇需酶1（inositol-requiring enzyme 1，IRE1）、活化转录因子6（activating transcription factor 6，ATF6）和双链RNA 依赖的蛋白激酶样ER 激酶（PKR-like ER kinase，PERK）并将信息传递给细胞的其他部分[7-8]。UPR 协调细胞的转录和翻译变化，上调分子伴侣的表达来参与折叠和稳定ER 腔内的蛋白质，通过ER 介导的降解途径（ER-associated degradation，ERAD）降解错误折叠的蛋白质和受调节的IRE1 依赖性mRNA 衰减（regulated IRE1-dependent decay of mRNA，RIDD）降低mRNA 浓度，恢复蛋白质稳态[9-10]。如果ER 腔内错误折叠蛋白质积累过多，细胞不能恢复蛋白质稳态，UPR 会抑制适应性反应，引发细胞凋亡[11-13]。

1.1 IRE1 信号通路 哺乳动物ER 膜上存在IRE1α和IRE1β 两个亚型，与IRE1β 相比，IRE1α 表达更广泛，功能更重要。生理条件下，IRE1α 的ER 腔内管腔区域（N-terminal luminal domain，NLD）与分子伴侣结合免疫球蛋白（binding immunoglobulin protein，BiP）结合，防止IRE1α 的活化。当ER 腔内错误折叠蛋白质蓄积，BiP 从NLD 区解离，帮助恢复ER 腔内蛋白质的折叠，IRE1α 二聚化[14]，激活胞质IRE1α 的核糖核酸内切酶区（ribonuclease，RNase）[15]，随后RNase 剪切下游转录调控因子未剪接型X 盒结合蛋白1（unspliced X-box binding protein 1，XBP-1u）的mRNA，使之转录出具有活性的剪接型X 盒结合蛋白1（spliced X-box binding protein 1，XBP-1s）[16]。IRE1α 可以通过非常规剪接XBP-1u mRNA，或通过RIDD，启动UPR 的下游信号[17-21]。IRE1α 对ER 内进行翻译的mRNA 进行RIDD，以防止ER 腔内蛋白质折叠的进一步增加[22]。与此同时，非常规剪接XBP-1u mRNA 诱导ER 质量控制元件的转录，通过增强ER 内蛋白质折叠能力恢复ER 稳态。如果仍不能恢复ER 稳态，IRE1α 会停止剪接XBP-1u mRNA，并且通过RIDD 抑制适应性反应并激活细胞凋亡[22-23]。在恢复ER 稳态失败到启动凋亡的过渡阶段，RIDD 通过降解选择性UPR 靶基因（包括分子伴侣BiP）增加ERS 强度[22]。一旦ERS 强度达到阈值，RIDD 通过抑制抗凋亡前体mRNAs[23]，启动细胞凋亡。

1.2 ATF6 信号通路 ATF6 是定位于ER 膜上的ERS跨膜蛋白，具有ATF6α（90kDa）和ATF6β（110kDa）两种亚型。其N 端是含有碱性亮氨酸拉链的转录激活功能域，C 端位于ER 腔内，具有多个BiP 结合位点和两个高尔基体定位信号[24-25]。与IRE1α 相似，ATF6α 的ER 腔内C 端与BiP 结合使其停留在ER 膜上。当发生ERS 时，BiP 解离促使ATF6α 转移到高尔基体，由高尔基体蛋白酶S1P 及S2P 对其跨膜片段进行剪切，产生活化的ATF6α（50kDa）片段进入细胞核，促进含ERS 反应元件的转录因子及分子伴侣（如BiP、葡萄糖调节蛋白94）等基因转录，恢复蛋白质折叠稳态[26-27]。Yoshida等[28]发现XBP-1u 也是ATF6 的一个下游靶基因，活化ATF6α 上调XBP-1u mRNA 转录，再通过IRE1α 的非常规剪接形成XBP-1s。这说明ERS 信号通路的激活和生物学功能不是互相独立的。

1.3 PERK 信号通路 PERK 是一种只存在于动物细胞中的Ⅰ型ER 跨膜蛋白激酶，主要通过控制蛋白质合成和调节氧化应激来恢复蛋白质折叠稳态[29]。与IRE1 活化方式类似，二聚化的PERK 通过磷酸化真核起始因子2（eukaryotic initiation factor 2 alpha，eIF2α），进而抑制普通蛋白质的翻译，减少蛋白质在ER 腔内合成[30]。磷酸化的eIF2α 也可以选择性激活包括活化转录因子4（activating transcription factor 4，ATF4）在内的mRNA 的翻译[31]，ATF4 诱导发挥蛋白质合成和分泌作用、氨基酸合成和转运作用以及抗氧化应激作用的相关基因的转录增强[32-33]。当发生不可逆损伤时，ATF4上调C/EBP 同源蛋白、活性氧家族和凋亡调节因子B淋巴细胞瘤-2 基因家族蛋白表达，诱导细胞凋亡[34]。

2 蛋白质错误折叠相关疾病

2.1 AD 许多神经退行性疾病的病理特征之一是神经元和神经胶质细胞ER 腔内错误折叠蛋白质的积累。AD 是一种常见的年龄依赖性神经退行性疾病，其病理学特征是细胞内由过度磷酸化tau 蛋白组成的神经纤维缠结和细胞外β 淀粉样蛋白（amyloid-β，Aβ）的沉积[35]。可溶性tau 蛋白已被证明通过靶向和损害ERAD相关的成分而引起ERS[36]。Lourenco 等[37]研究发现Aβ寡聚体可以通过TNF-α 通路诱导ERS，随后会导致下游激酶的活化，如糖原合成酶激酶3，该激酶能够随后磷酸化tau 蛋白上的特异性位点，从而促进神经纤维缠结的形成[38]。而对于Aβ 的研究更多集中在Aβ 前体蛋白（Aβ precursor protein，APP）及跨膜蛋白早老素1（presenilin-1，PS1）和早老素2（presenilin-2，PS2）。早期研究发现家族性AD 相关PS1 突变抑制IRE1α 的激活，降低了分子伴侣的合成[39]。随后，Katayama 等[40]在神经纤维瘤细胞和成纤维细胞家族性AD 相关PS1 突变细胞株上研究发现，突变PS1 蛋白干扰PERK 通路的激活以及活化ATF6 蛋白在细胞核中的积聚。异常剪接的PS2 亚型也与AD 有关，该亚型降低了细胞对ERS 的耐受[41]。除此之外，PS1 和PS2 突变体过表达扰乱了ER 腔Ca2+稳态，提示存在于早衰素基因中的基因突变对AD 起作用的另一种机制[42]。由于对ERS 在AD中是如何产生的认知有限，因此需要更多的研究来充分认识UPR 信号通路是如何导致AD 的。

2.2 LQTs LQTs 是一种离子通道疾病，人ERG（human ether-a-go-go-related gene，HERG）基因突变引起遗传性LQTs，表现为快速激活延迟整流钾电流（rapidly activating component of delayed rectifier potassium current，Ikr）减少和心室复极延[43]。HERG mRNA 在ER 核糖体合成一条单体蛋白质并完成核心糖基化，4 个核心糖基化蛋白质单体聚合成一个四聚体HERG 通道。迄今已发现300 多个HERG 基因突变位点，其中HERG-△bpl261、△I500-F508、Q752X 等突变基因编码的单体蛋白质与野生型基因编码的单体蛋白质不能聚合成Ikr 通道，自身折叠错误滞留在ER 腔内或到达细胞膜却不能发挥正常功能[44-46]；A561V、G572R、N470D 突变基因编码的单体蛋白质与野生型基因编码的单体蛋白质可正常聚合成Ikr 通道，根据突变位点不同，导致滞留信号暴露或退出信号遮盖，最终滞留在ER 中诱发ERS，少部分转运到细胞膜上的Ikr 通道因突变引起功能缺失[44-46]。药物可以导致获得性LQTs（acquired long QT syndrome，aLQTs），除直接阻滞HERG 通道外，也伴随抑制HERG 通道蛋白转运而减少细胞膜上Ikr通道[47]。三氧化二砷（As2O3）抑制分子伴侣热休克蛋白70、热休克蛋白90，影响HERG 蛋白从ER 转运至高尔基体，导致aLQTs[48]。Yan 等[49]在此基础上研究发现As2O3可以加速溶酶体降解滞留在ER 腔内的HERG蛋白，化学分子伴侣非索非那定和白藜芦醇帮助HERG 蛋白正确折叠并向高尔基体转运。

3 药物干预ERS

ERS 与许多疾病发病相关，因此，UPR 通路可能是调节ERS 及相关疾病的重要治疗靶点。以往ERS 治疗作用的研究主要集中在ERS 激活凋亡信号通路引起肿瘤细胞凋亡以及肿瘤微环境中的ERS 调节内皮细胞等癌支持基质细胞的功能，抑制肿瘤生长[50]。近年研究发现，干预ERS 可以纠正蛋白质的错误折叠和转运，增加相关蛋白质转运和表达，并在一定程度上恢复其功能。牛磺熊去氧胆（tauroursodeoxycholic acid，TUDCA）是个类似于分子伴侣的小分子化合物，能够促进ER 腔中蛋白质向胞质方向的运输，从而减轻ERS[51]。Frump等[52]对肺动脉高压的Bmpr2△Ex2 突变蛋白进行研究发现，在用TUDCA 孵育后，突变蛋白在细胞膜上的表达明显增加，这提示TUDCA 可以恢复突变蛋白向细胞膜的转运，有利于促进正常蛋白的转运。Uppala 等[53]发现在心肌纤维化的动物模型中，TUDCA 通过IRE1α-XBP-1 通路，维持ER 稳态，从而防止心肌纤维化的发生。ERS 激动剂毒胡萝卜素可以通过对ER 中钙-三磷酸腺苷酶的抑制作用，选择性地纠正跨膜蛋白HERG通道功能障碍的能力[54-56]。这就需要我们更加全面地了解ERS 以及其在不同疾病中扮演的角色，为疾病治疗提供新的理论依据。

4 展望

尽管我们已经了解蛋白质折叠的机制以及ERS调控蛋白质错误折叠的适应性反应，但是ERS 在蛋白质错误折叠相关疾病中发挥作用的机制未完全阐明。现阶段的研究中大多采用测量UPR、Ca2+、氧化应激水平等间接指标反映ERS 水平，而且体外检测ERS 腔中错误折叠蛋白质聚集的方法在体内实验的效果不佳，在人类疾病中发生的蛋白质错误折叠的严重程度以及哪些蛋白质发生错误折叠仍不清楚。除蛋白质错误折叠，炎症、感染、缺氧等病理状态都可以激活ER[50]。因此，这些指标的变化不能完全体现ERS 水平，必须开发新技术来监测ER 腔内蛋白质的折叠状态。由于UPR 通路通常只在ERS 后短暂激活，因此需要在ERS早、中、晚不同时期检测UPR 水平。此外，年龄相关性退行性疾病通常与蛋白质聚集物和氧化产物的积累有关，ERS 在这些疾病发生、发展过程中是因还是果需要进一步研究。UPR 信号可以从一个细胞传输到另一个细胞，有时可以跨越相当长的距离。例如，ERS 状态下的肿瘤细胞可以上调巨噬细胞中促炎细胞因子的表达[57]；神经元XBP-1s 的表达可以激活肠道和肝脏组织中的UPR[58-59]，但信号传递机制仍不清楚。探究在疾病中UPR 激活和传递的机制将有助于我们进一步寻找新的治疗靶点。