磷酸三苯酯(TPP)和磷酸三(2-氯异丙基)酯(TCPP)诱导人胚肾细胞HEK293凋亡的机制研究

王晓晴，刘佳琳，李斐,*，曹天贵，吴惠丰,2，孟祥敬，吉成龙,2

1. 中国科学院海岸带环境过程与生态修复重点实验室，中国科学院烟台海岸带研究所，山东省海岸带环境过程重点实验室，烟台 264003 2. 青岛海洋科学与技术国家实验室，海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室，青岛 266237 3. 中国科学院大学，北京 100049

随着溴系阻燃剂在全球范围内被逐步禁用，有机磷酸酯阻燃剂(OPFRs)被广泛应用于建筑材料、电子产品、塑料制品、家装饰品和纺织品中，降低各种材料的易燃性[1]。由于是添加型阻燃剂，OPFRs进入环境的几率较高，目前已经在大气、水体等多种环境介质及生物体中检出OPFRs，并且其浓度呈现逐年增长的趋势[2-5]。释放到环境中的OPFRs在结构上类似于具有神经毒性的有机磷杀虫剂，具有潜在的环境和健康风险[6-13]，Dishaw等[1]发现，磷酸三(2-氯异丙基)酯(TCPP)、磷酸三(2-氯乙基)酯(TCEP)和磷酸三(1,3-二氯异丙基)酯(TDCPP)等通过减少细胞数量、改变神经分化等方式影响神经发育，研究表明，部分OPFRs具有与四溴联苯醚(BDE-47)和部分有机磷农药相当甚至更强的神经发育毒性。Liu等[6]研究发现，斑马鱼暴露于TCPP和TDCPP后，均能显著干扰其体内性激素的平衡，具有一定的内分泌干扰作用。此外，研究发现，室内灰尘中含有多种较高浓度的OPFRs，对人体健康具有潜在的不良影响。例如，Meeker和Stapleton[7]发现，室内粉尘中检测到的部分高浓度OPFRs包括TDCPP和磷酸三苯酯(TPP)会降低男性相关激素水平(甲状腺激素和雄性激素)和精子浓度，造成精液质量下降，甚至可能引起不孕不育等不良结局。Wang等[8]的研究显示，烷基和芳基取代的OPFRs能够显著抑制氨基酸脱氢酶的活性。因此，深入研究OPFRs的毒性机制是极为必要的，为该类化合物污染的早期防控和管理提供基础理论数据。

肾脏是生物体的重要器官，在机体进行代谢、排毒和调节内稳态等方面发挥着重要作用。若肾脏细胞(人胚肾细胞HEK293)受损，很可能干扰肾脏的正常功能，对机体造成不利影响。目前，关于OPFRs对肾细胞毒性的研究尚不充分，有必要探讨OPFRs对HEK293细胞的毒理效应机制。细胞凋亡已被认为是污染物对细胞毒性效应的重要表现。近年来，已有研究表明，OPFRs可刺激细胞诱导细胞凋亡[14-18]。线粒体作为执行细胞凋亡的主要细胞器[19]，在凋亡发生过程中，伴随着线粒体功能(膜通透性改变、膜电位的降低)和形态的改变，导致胞内活性氧(ROS)水平的升高，进而通过DNA损伤的方式诱导细胞凋亡[20]。作为关键抑癌基因p53，其突变与半数肿瘤的发生相关[21-22]。当污染物小分子以较强的作用力(嵌插作用或共价结合)结合DNA时，可通过抑制DNA的复制转录或碱基错配等方式，引起DNA点突变[23-24]。目前有关OPFRs诱导细胞凋亡机制的研究工作也已展开，但凋亡效应机制尚不明晰。

本研究选取2种代表性OPFRs(TPP和TCPP)，采用流式细胞仪和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术，研究了TPP和TCPP对人胚肾细胞HEK293的相关基因(细胞增殖、细胞凋亡和氧化应激)表达量变化的影响，探讨其诱导细胞凋亡的机制。鉴于OPFRs对HEK293细胞中p53基因的表达水平均可造成影响，结合紫外-可见光谱和荧光光谱，进一步检测了TPP和TCPP与p53-DNA之间的结合方式并计算结合作用常数，研究TPP和TCPP诱导的细胞ROS升高、造成的DNA损伤与细胞凋亡之间的相关性，阐明TPP/TCPP与p53基因的作用机制，为OPFRs的毒性效应机理研究提供参考依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 仪器与试剂

仪器：SW-CJ-1FD型洁净工作台和YXQ-LS-50SII立式压力蒸汽灭菌锅(上海博迅实业有限公司)；INCO2/108型二氧化碳培养箱(德国Memmert公司)；XDS-1B型倒置生物显微镜(重庆光学仪器厂)；5804R台式高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；FACSAria流式细胞仪(美国BD公司)；Nanodrop2000微量紫外分光光度计(美国Thermo公司)；7500Fast实时荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)。

试剂：TPP和TCPP购自德国Dr. Ehrenstorfer公司；胎牛血清、DMEM培养基、胰蛋白酶、青霉素及链霉素溶液(双抗)以及磷酸盐溶液(phosphate buffered saline, PBS)均购自美国Hyclone公司；二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)，纯度>99%，购自美国MP Biomedicals公司；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；2’,7’-二氯荧光素双乙酸盐(2’,7’-dichlorodihydrofluorescin diacetate, DCFH-DA)购自美国Sigma公司；TRIzol总RNA提取试剂购自日本宝生物工程株式会社；SYBR Green实时定量PCR试剂盒购自美国Applied Biosystems公司。其他试剂均为国产分析纯，实验用水为超纯水。

1.2 细胞培养及细胞增殖

将复苏的HEK293细胞培养在完全培养基(90% DMEM培养基中加入10%的胎牛血清和1%的双抗)中，培养条件为37 ℃、5% CO2和相对湿度95%。传代培养，直至细胞达到对数生长期。TPP/TCPP溶于二甲基亚砜(DMSO)制成不同浓度的暴露溶液，等量的DMSO作为溶剂对照组。

达到对数生长期的HEK293细胞，经PBS清洗、胰蛋白酶消化、培养液重悬、离心和弃上清液后，再次加入培养液，并将其接种于96孔板中，进行培养。每孔加入终浓度分别为0 (溶剂对照组)、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5和10-4mol·L-1的TPP及TCPP暴露溶液。培养24 h后，加入培养液和CCK-8试剂，于培养箱孵育1 h，使用酶标仪测吸光度(450 nm)。

1.3 细胞凋亡及活性氧(ROS)的影响

将处于对数生长期的HEK293细胞暴露于不同浓度(10-6、10-5和10-4mol·L-1)的TPP和TCPP中，细胞培养24 h后，经染色处理(细胞凋亡测定采用Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒染色，ROS水平测定采用DCFH-DA荧光染料染色)，上样分析。

细胞凋亡：收集暴露后的细胞用PBS缓冲液重悬，按照操作手册加入相应剂量的Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)，分别避光孵育。使用流式细胞仪进行检测(细胞数量为1×104个)，分析细胞凋亡率。

细胞内ROS水平：收集暴露后的细胞用PBS缓冲液重悬，加入5 μL 5×10-4mol·L-1的DCFH-DA溶液，避光孵育1 h。使用流式细胞仪测定细胞内DCFH荧光强度，参数设置为：激发波长488 nm，发射波长525 nm。

1.4 凋亡相关基因表达水平的检测

采用TRIzol法提取RNA。加入氯仿离心分层样品，收集上清液(含RNA)，向其中加入异丙醇，用于沉淀还原RNA(实验条件≤0 ℃，用以抑制RNA酶的活性)。采用微量紫外分光光度计测定RNA浓度(浓度范围：A260 nm/A280 nm介于1.8～2.2，A260 nm/A280 nm分别为RNA于260 nm与280 nm处吸光度)。将样品浓度调至500 mg·L-1，进行cDNA反转。随后，采用SYBR Green荧光定量试剂盒进行qRT-PCR检测，检测凋亡相关基因的表达水平，2-ΔΔCt法处理数据[25]。

1.5 分子模拟

分子模拟技术被用于研究小分子配体与双螺旋DNA间的结合位点和作用模式，进而确定两者的结合作用机理。首先，通过网站(http://structure.usc.edu/make-na/server.html)获得p53基因的三维结构。采用Discovery studio 2.5(简称DS 2.5)研究TPP/TCPP与p53基因片段间的结合构象，相关参数采用默认设置。采用动力学和模拟退火方法优化和精确配体-受体构象。分子对接的结果有助于剖析OPFRs与p53基因片段间的关键相互作用。

1.6 光谱法测定TPP/TCPP与p53基因的相互作用

光谱法通过测定吸光度及荧光强度的改变，研究小分子配体与DNA间相互作用。目前广泛利用紫外-可见吸收光谱法和荧光光谱法研究污染物与DNA之间的作用。

紫外-可见吸收光谱法利用DNA碱基的光学特性，研究污染物结合DNA对吸收峰的峰位置及峰强度的影响。通过p53基因启动子区域片段(p53-DNA)的2条互补单链DNA序列合成双链p53-DNA溶液(5×10-4mol·L-1)。将p53-DNA稀释至2×10-6mol·L-1，并与TPP和TCPP溶液等体积混合，配制成一定浓度的混合溶液(混合溶液中TPP/TCPP的浓度为0、1×10-6、2×10-6、4×10-6、6×10-6、8×10-6和10×10-6mol·L-1，p53-DNA的浓度为1×10-6mol·L-1)。避光反应2 h后，进行紫外-可见吸收光谱扫描，扫描范围为190～350 nm。

图1 磷酸三苯酯(TPP)和磷酸三(2-氯异丙基)酯(TCPP)对HEK293细胞增殖的影响注：与对照组相比，* P<0.05、** P<0.01。Fig. 1 Effect of triphenyl phosphate (TPP) and tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate (TCPP) on the proliferation of HEK293 cellsNote:*P<0.05, **P<0.01, compared with the control.

荧光光谱法利用溴化乙锭(EB)嵌入结合DNA产生荧光，EB本身不具备较强的荧光，与DNA结合后荧光强度大大增强。基于此特性，可通过检测不同浓度下TPP/TCPP对EB-p53-DNA体系荧光强度的影响，研究污染物小分子与DNA间的相互作用。用PBS缓冲液稀释p53-DNA溶液，p53-DNA稀释液(1×10-6mol·L-1)与EB原液(1×10-3mol·L-1)按1:100的比例混合，避光30 min，使两者充分结合，得到EB-p53-DNA体系。将不同体积的TPP/TCPP原液与EB-p53-DNA体系混合，配成终浓度为0、1×10-6、2×10-6、4×10-6、6×10-6、8×10-6和10×10-6mol·L-1的混合液。避光反应2 h后，采用荧光分光光度计进行荧光光谱扫描，参比溶液为PBS缓冲液、扫描范围为190～350 nm，发射波谱范围为500～800 nm，激发波长为480 nm。

2 结果(Results)

2.1 TPP和TCPP对HEK293细胞增殖的影响

通过CCK-8试剂盒检测TPP及TCPP对HEK293细胞增殖的影响，结果如图1(a)和1(b)所示，10-9～10-4mol·L-1TPP及TCPP对细胞增殖存在从促进到抑制的过程(P<0.05)。因此，选取后续暴露浓度10-6、10-5和10-4mol·L-1。

2.2 TPP和TCPP对HEK293细胞凋亡及ROS的影响

处于对数生长期的HEK293细胞经暴露培养24 h后，基于Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒及DCFH-DA荧光染料，通过流式细胞仪分别观测其细胞凋亡情况及细胞内ROS水平。图2(a)和图2(b)分别为不同浓度TPP和TCPP对HEK293细胞凋亡及胞内ROS水平的影响。

由图2(a)可知，与对照组相比，TPP暴露组的凋亡率显著上升(P<0.05)，且与浓度呈正向的剂量-效应关系；TCPP浓度为10-5和10-4mol·L-1时，细胞凋亡率亦显著上升(P<0.05)；在各浓度组中，TPP比TCPP造成的细胞凋亡率更高。证明一定浓度的TPP和TCPP均可诱导HEK293细胞凋亡，TPP更易诱导HEK293的细胞凋亡。由图2(b)可知，TCPP各暴露组相对于对照组ROS水平均显著上升(P<0.05)，与凋亡结果相一致；而TPP则表现为：10-6和10-5mol·L-1暴露组显著提高细胞内的ROS水平(P<0.01)，而在10-4mol·L-1暴露组中，ROS含量显著降低(P<0.01)，这可能由于高浓度(10-4mol·L-1)的TPP导致大量细胞死亡及破碎，导致胞内ROS水平无法被检测到。Chen等[26]研究发现，TPP可以诱导氧化损伤，影响抗氧化酶和相关基因的表达，包括谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽S-转移酶(GST)。

图2 TPP和TCPP对HEK293细胞凋亡和细胞内活性氧(ROS)水平的影响注：与对照组相比，* P<0.05、** P<0.01。Fig. 2 Effects of TPP and TCPP on apoptosis and reactive oxygen species (ROS) level in HEK293 cellsNote: compared with the control, * P<0.05, ** P<0.01.

2.3 TPP和TCPP对HEK293细胞凋亡相关基因表达量的影响

处于对数生长期的HEK293细胞暴露培养24 h后，采用TRIzol法提取RNA，经变性、反转后获得cDNA。采用SYBR Green荧光定量试剂盒进行实时荧光定量PCR。选取的凋亡相关基因主要包括p53、Bcl-2家族成员的编码基因(Bcl-2、Bax、Bad和Hrk)以及Caspases家族成员的编码基因Caspase7。目的基因及内参基因(HPRT1)引物设计如表1所示。对qRT-PCR数据采用2-ΔΔCt法进行处理，得到HEK293细胞中各凋亡相关基因表达水平的变化如表2所示。

与对照组相比，TPP暴露组中，除了Bax及Hrk基因的表达量，p53、Bcl-2、Bad和Caspase7基因的表达量随TPP和TCPP浓度的升高而逐渐增加。在10-6mol·L-1及10-5mol·L-1TPP暴露组中，Bcl-2表达量显著上升(P<0.05)；10-4mol·L-1TPP暴露使Bad及Caspase7表达量显著上升(P<0.05)，p53及Bcl-2表达量显著上升(P<0.01)。在10-5mol·L-1TCPP暴露组中，p53及Bax表达量显著上升(P<0.05)，Hrk表达量显著上升(P<0.01)；10-4mol·L-1TCPP暴露使p53、Bax、Bcl-2及Caspase7表达量显著上升(P<0.05)，使Bad及Hrk表达量显著上升(P<0.01)。基因表达量的显著改变，指示了线粒体途径中的Bcl-2家族通过相互作用共同促使MPTP开放，进而导致HEK293细胞的凋亡。

qRT-PCR结果显示，中浓度组(10-5mol·L-1)及高浓度组(10-4mol·L-1)的TPP及TCPP暴露上调了p53基因的表达水平，推测过多ROS的产生造成DNA损伤，进而促使p53基因过表达参与细胞凋亡。这与细胞凋亡结果存在一致性，且p53基因的表达水平随OPFRs浓度的升高而上调。这说明，p53基因在TPP及TCPP诱导的HEK293细胞凋亡中同样发挥重要作用。此外，TPP及TCPP暴露上调了HEK293细胞p53及Bax基因，推测2种典型OPFRs通过上调细胞内p53基因水平，进而促进Bax的表达并转移至线粒体。此外，表2中Caspase凋亡执行因子Caspase7的表达量在TPP及TCPP的高浓度组(10-4mol·L-1)被上调，说明在线粒体途径后期，Caspase7被激活，进而实现凋亡。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Gene-specific primer sequences used for qRT-PCR

2.4 分子模拟TPP/TCPP与p53-DNA的相互作用

基于qRT-PCR的实验结果，选取p53基因作为与凋亡相关的靶标基因，通过分子对接研究TPP/TCPP分子与p53间的相互作用方式。如图3所示，TPP/TCPP与DNA分子通过氢键、疏水和π-π相互作用紧密结合。TPP的苯环通过嵌入方式插到DNA双螺旋结构中，从而损伤双螺旋结构(图3(a))，TCPP通过沟槽结合方式影响DNA结构(图3(b))。

2.5 TPP/TCPP与p53-DNA结合作用的研究

通过分子对接构象分析，发现TPP和TCPP能够与p53结合，插到DNA的双螺旋中，从而损伤双螺旋结构。进一步采用光谱法从分子水平探究TPP及TCPP诱导细胞凋亡的效应机制。

紫外-可见吸收光谱法研究发现，加入TPP/TCPP后，p53基因片段在255 nm处的吸收峰峰位随OPFRs浓度的增加而产生蓝移(1.0～3.5 nm)，详情见表3。吸光度随OPFRs浓度的增加而增大，产生增色效应(图4(a)和图4(c))，这说明，TPP/TCPP可能通过插入p53-DNA碱基对中，破坏DNA双螺旋结构。图4(b)和图4(d)为不同浓度TPP/TCPP与EB-p53-DNA相互作用的荧光光谱。TPP/TCPP使得EB-DNA体系的荧光强度(597 nm)随OPFRs浓度的增加而减小，造成荧光猝灭。

图3 TPP/TCPP分子与p53在结合位点的相互作用注： 配体键， 受体键，氢键，具有疏水作用的受体氨基酸残基，相应的具有疏水作用的原子。Fig. 3 Docking views of TPP/TCPP and hydrophobic interaction between TPP/TCPP and p53 gene in the binding siteNote: Ligand bond; Non-ligand bond; Hydrogen bond and its length; Non-ligand residues involved in hydrophobic contacts; Corresponding atoms involved in hydrophobic contacts.

图4 TPP/TCPP与p53-DNA片段相互作用的紫外和荧光光谱注：1～7表征不同浓度组，依次为0、1×10-6、2×10-6、4×10-6、6×10-6、8×10-6和10×10-6 mol·L-1。Fig. 4 The UV-Vis spectra and fluorescence spectra of the interaction between TPP/TCPP and p53-DNA fragmentsNote: Curve 1 to 7 representing different concentration groups, i.e., 0, 1×10-6, 2×10-6, 4×10-6, 6×10-6, 8×10-6 and 10×10-6 mol·L-1.

表2 不同浓度TPP/TCPP对HEK293细胞凋亡相关基因表达量的影响Table 2 The expression of apoptosis-related genes in HEK293 cells under different concentrations of TPP/TCPP

注：与对照组相比，*P<0.05、**P<0.01。

Note: compared with the control,*P<0.05,**P<0.01.

表3 TPP/TCPP与p53基因片段作用的紫外和荧光光谱相关数据Table 3 Relevant data values of ultraviolet and fluorescence spectra of TPP/TCPP and fragments of p53 gene

3 讨论(Discussion)

Bcl-2家族对细胞凋亡具有重要的调控作用，其中既有促进凋亡的蛋白(如Bax)，也有抑制凋亡的蛋白(如Bcl-2)[27-28]。Bcl-2家族成员大多数定位于线粒体外膜上。因此，Bcl-2家族主要通过改变线粒体膜的通透性，进而影响内源线粒体凋亡途径来调控凋亡[27]。本研究选取了一系列Bcl-2家族蛋白的编码基因进行研究，包括Bcl-2(抑制凋亡)、Bax、Bad和Hrk(促凋亡)。其中，Bax基因的启动子能够结合与DNA损伤修复相关的p53基因。当外界刺激或内源活性氧升高造成DNA损伤时，p53基因首先通过阻碍细胞周期，抑制细胞增殖，进而修复损伤。当损伤无法修复时，p53基因又通过多种途径诱导细胞凋亡[29-31]。故在凋亡早期，p53基因能够促进Bax的转录表达[29]。本实验中，Bax基因的表达水平在TPP和TCPP高浓度组(10-4mol·L-1)均出现上调趋势，推测TPP和TCPP上调HEK293细胞内的p53基因水平，进而促进Bax的表达并转移至线粒体中。

Caspase家族是凋亡的主要参与者，在线粒体途径后期，细胞色素c(cyt c)被线粒体释放至胞质中。cyt c与凋亡蛋白活性因子-1(Apaf-1)结合，在dATP/ATP存在下，活化Caspase9，进而激活下游的Caspase凋亡执行因子Caspase7，实现细胞凋亡。结合转录水平的结果，分析TPP及TCPP诱导HEK293细胞凋亡的机制(图5)。一定剂量的TPP及TCPP通过上调HEK293细胞内的p53基因水平，促进Bax等基因的表达，进而在线粒体途径中释放cyt c，最终激活Caspase7实现凋亡。

分子模拟技术有助于研究小分子配体与受体间的结合作用机理[32]。研究表明，小分子与双螺旋DNA的结合方式主要包括静电式、嵌入式和沟槽式[33-34]。分子对接的结果显示，TPP及TCPP与p53片段通过嵌入式和沟槽式结合，嵌插到DNA双螺旋中，进而损伤DNA结构。结合紫外及荧光谱图分析发现，EB的置换量与TPP的浓度呈现正相关关系。推测TPP在嵌入式结合p53片段的过程中，同EB竞争p53-DNA的结合位点，将EB从DNA的双螺旋中置换出来，造成结合DNA的EB浓度降低，体系荧光强度减弱。而TCPP以沟槽方式结合p53-DNA，改变基因片段的框架结构，造成EB的流出，引起荧光猝灭。结合实验和分子对接结果，说明了TPP/TCPP与p53的结合，在一定程度上影响了p53-DNA的结构，进而干扰了相关基因(Bax、Hrk、Bcl-2和Bad)的转录、翻译和表达，导致线粒体途径释放cyt c，最终激活Caspase7实现细胞凋亡。本研究探讨了典型OPFRs诱导凋亡的有害结局通路(AOP)通路，为化学品的污染防控提供基础参考数据。

图5 TPP/TCPP诱导HEK293细胞凋亡通路图Fig. 5 The apoptosis pathway of HEK293 cells induced by TPP/TCPP