以猪小肠黏膜提取物作为α-葡萄糖苷酶和二肽基肽酶IV的酶活力分析体系的建立

甲承立，Naveed HUSSAIN，董 洁，王 芬，李函彤，张书文，芦 晶，逄晓阳，刘 鹭，吕加平,

（1.中国农业科学院农产品加工研究所，农业农村部农产品加工重点实验室，北京 100093；2.山西农业大学食品科学与工程学院，山西 晋中 030800；3.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457；4.北京市营养源研究所系统营养工程技术研究中心，北京 100069）

随着人们生活水平的提高，糖尿病的发病率也在逐年上升，成为继肿瘤、心血管疾病的第三大疾病[1]。其中，II型糖尿病患者占所有糖尿病患者的90%以上。II型糖尿病是由胰岛素分泌不足、胰岛素抵抗以及机体肝脏、脂肪等细胞内的血糖氧化利用过程受到了阻碍发生高血糖等原因造成的[2]。

α-葡萄糖苷酶又称α-D-葡萄糖苷水解酶（α-glucosidase，GAA），主要存在于小肠刷状缘细胞膜上。GAA主要通过切开低聚糖非还原末端的α-1,4糖苷键方式水解低聚糖。抑制α-葡萄糖苷酶活性有利于减缓葡萄糖的生成和吸收，从而降低血糖水平。α-葡萄糖苷酶可将底物对硝基苯基α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenylα-D-glucopyranoside，PNPG）水解为黄色的对硝基酚（p-nitrophenol，PNP）[3]，从而可通过PNP的浓度来衡量α-葡萄糖苷酶的体外活性。Shantha Kumara等[4]发现Brettanomyces lambicus菌体内存在两种α-葡萄糖苷酶，即胞内α-葡萄糖苷酶和胞外α-葡萄糖苷酶，胞内酶为脂溶性酶，一部分与细胞膜结合，且含量比胞外酶高。因此，本研究提取制备α-葡萄糖苷酶时需将猪小肠黏膜提取物研磨破碎。

二肽基肽酶IV（dipeptidyl peptidase 4，DPP-4）是广泛存在于细胞膜上的一类具有潜在的调节免疫、内分泌以及神经系统等功能的膜结合丝氨酸蛋白酶，存在于多种器官中且家族成员众多[5]。DPP-4能快速降解胰高血糖素样肽（glucagon-like peptide，GLP）-1与葡萄糖依赖性胰岛素释放肽（glucose dependent insulinotropic polypeptide，GIP）。GLP-1、GIP这两种肽类激素能促进胰岛β细胞分泌胰岛素，并减少胰岛α细胞分泌胰高血糖素，从而降低血糖水平[6]。因此，开发出具有DPP-4抑制功能的活性物质或药物，可用于Ⅱ型糖尿病的防治。DPP-4体外酶活力的测定主要是依据DPP-4能催化水解底物甘氨酸脯氨酸对硝基苯胺（Gly-Pro-p-nitroanilide，Gly-Pro-pNA）生成黄色的pNA[7]。

近年来，具有Ⅱ型糖尿病辅助治疗作用的α-葡萄糖苷酶抑制剂和DPP-4抑制剂引起广泛关注[8]。在研究中，筛选这两种抑制剂的常用酶多来自于酵母等微生物[9-10]。目前市场上已有多种商业化α-葡萄糖苷酶和DPP-4，一方面价格昂贵；另一方面这些主要来源于微生物代谢产物的商业化酶与哺乳动物肠道内α-葡萄糖苷酶和DPP-4有一定的差异性，不适合于用作这两种酶抑制剂的筛选。Zeng Zhu等[11]从猪小肠中提取黏膜分泌物作为α-葡萄糖苷酶，筛选了多种具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的乳酸菌；原爱红[12]、Zhang Jianfen[13]等报道了大鼠大肠黏膜提取糖苷酶的工艺；张超等[7]从DPP-4/CHO工程株细胞中提取DPP-4，建立了一个DPP-4抑制剂的筛选模型；陈静等[14]从分化成熟的人克隆结肠腺癌细胞（Caco-2细胞）中提取DPP-4，并建立了体外筛选DPP-4抑制剂的模型。但从哺乳动物小肠同时提取α-葡萄糖苷酶、DPP-4并建立测定方法的研究并不多。本研究以新鲜猪小肠为原料，对小肠不同部位的α-葡萄糖苷酶和DPP-4的分布及活力进行分析。不同部位小肠黏膜提取物均具有高浓度的α-葡萄糖苷酶和DPP-4，两种酶混合在一起，通过商业酶分别建立标准酶活力分析体系，将混合物稀释不同倍数，和对应的底物反应，确定混合物中两种酶的活力及比活力，从而建立猪小肠源α-葡萄糖苷酶及DPP-4活力分析体系，为筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂和建立DPP-4抑制剂测定方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜猪小肠购自北京第五肉联厂。

酵母源α-葡萄糖苷酶、重组人源DPP-4、PNPG、Gly-Pro-pNA 美国Sigma公司；阿卡波糖 意大利J&K公司；抑二肽素A（diprotin A，IPI） 英国Abcam公司；BCA蛋白定量试剂盒 美国Biomiga公司；无水碳酸钠等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Spark 20M全波长酶标仪 瑞士TECAN公司；3K15离心机 德国Sigma公司；xianou-48高通量组织研磨仪南京先欧仪器制造有限公司；MB-102恒温金属浴杭州博日科技有限公司；DHP-9082电热恒温培养箱上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 猪小肠黏膜液的制备

猪小肠黏膜液的制备参考文献[11]。将新鲜的猪小肠排出内容杂质后在-20 ℃冰箱冻存。使用时，37 ℃温水浴快速解冻，用4 ℃、pH 6.8的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗。在冰温环境下切开，用干净的载玻片刮取肠（十二指肠、空肠、回肠）黏膜及其表面黏液。取不同部位的黏膜提取物，加入与提取物等体积的PBS（4 ℃、pH 6.8），低温下匀浆，4 ℃、4 000 r/min离心20 min，取上清液，于-80 ℃保存备用。

1.3.2 总蛋白质量浓度的测定

取十二指肠、空肠、回肠黏膜提取物各10 μL，加入990 μL PBS（pH 6.8）（相当于稀释100 倍），混匀，待测。BCA工作液、蛋白标准液配制及蛋白质量浓度的测定参考BCA蛋白定量试剂盒方法与文献[15]。

1.3.3 α-葡萄糖苷酶活力的测定

37 ℃时pH 6.8 PBS中，以1 min内催化PNPG反应生成1 μmol PNP所需α-葡萄糖苷酶的量为1 个酶活力单位[16]。PNP在405 nm波长处具有强烈光吸收，因此，可用1 min内吸光度的变化量表征酶活力。

α-葡萄糖苷酶活力的测定参考文献[17]。以96 孔板为反应载体，每个样品做3 个平行。反应体系为：实验组加入不同浓度的底物（PNPG）25 μL，空白组加入25 μL 0.1 mol/L PBS（pH 6.8），37 ℃恒温金属浴预热10 min，然后加入50 μL不同浓度的α-葡萄糖苷酶或猪小肠稀释液，37 ℃下反应一定时间，加入0.1 mol/L Na2CO3溶液100 μL终止反应。用酶标仪在405 nm波长处测定吸光度。考察不同酶解时间（0～24 min）、底物浓度（0～6 mmol/L）及酶浓度（0～50 U/L）对α-葡萄糖苷酶活力的影响。将猪小肠不同部位黏膜提取提取物分别稀释不同倍数，测定猪小肠黏膜提取物中α-葡萄糖苷酶活力。

1.3.4 DPP-4活力的测定

底物Gly-Pro-pNA在DPP-4的作用下发生降解，生成的pNA在405 nm左右波长处具有强烈光吸收，因此以单位时间内吸光度的变化量来表示酶活力[18]。

DPP-4活力的测定参考文献[19]，以96 孔板为反应载体，每个样品做3 个平行。反应体系为：实验组加入不同浓度的底物Gly-Pro-pNA 25 μL，空白组加入25 μL 0.1 mol/L PBS（pH 6.8），37 ℃恒温金属浴预热10 min，然后加入50 μL DPP-4（或猪小肠稀释液），37 ℃下反应一定时间，加入100 μL 0.1 mol/L Na2CO3溶液终止反应，用酶标仪测定溶液在405 nm波长处的吸光度。

1.3.5 酶活力测定体系的验证

阿卡波糖、IPI是α-葡萄糖苷酶的抑制剂，常被作为阳性药评价α-葡萄糖苷酶活力测定体系的有效性，同时可以作为对照评价其他抑制剂的效果。本实验通过测定阳性药物阿卡波糖和IPI（样品）对酵母源α-葡萄糖苷酶、重组人源DPP-4、猪小肠提取物稀释液（底物）的抑制活性，对酶促体系进行评价[20-21]。操作步骤见1.3.3节和1.3.4节。α-葡萄糖苷酶、DPP-4抑制率的计算见下式[22]。

式中：A1、A2、A3、A4代表不同反应体系的吸光度，其中A1体系中含底物，样品用PBS（0.1 mol/L、pH 6.8，下同）代替；A2体系中底物和样品均用PBS替代；A3体系中含底物和样品；A4体系中底物用PBS替代，含样品。

1.4 数据处理与分析

实验结果采用SPSS17.0统计软件，使用单因素方差分析法进行差异显著性分析，Origin 8.0软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 猪小肠不同部位的黏膜提取物的α-葡萄糖苷酶活力

2.1.1 α-葡萄糖苷酶活力测定体系的建立

图1 α-葡萄糖苷酶在不同酶促条件下的活力Fig. 1 α-Glucosidase activity under different enzymatic reaction conditions

利用商业化酵母来源的α-葡萄糖苷酶建立其活力的测定体系，获得酶活力标准曲线，并以此为标准，确定不同部位猪小肠黏膜提取物的α-葡萄糖苷酶活力。如图1A所示，在底物浓度为5 mmol/L、酶浓度为50 U/L条件下，反应时间与体系吸光度关系呈现抛物线形式。0～15 min内α-葡萄糖苷酶与底物PNPG迅速反应，吸光度呈线性变化，说明α-葡萄糖苷酶在0～15 min内的量充足。18 min后，吸光度变化放缓，说明底物的量已无法满足反应的进行，反应21 min后，吸光度无显著变化（P＞0.05），酶促反应条件应准确描述酶促反应的初速率，因此确定15 min为最佳酶促反应时间。

如图1B所示，在酶浓度为50 U/L下反应15 min，底物浓度与体系吸光度之间呈现典型的抛物线形式，即底物浓度较低时，反应速率较大，吸光度变化较快；当底物浓度大于3 mmol/L时，反应体系吸光度无显著变化（P＞0.05）。当底物浓度达到5 mmol/L时，吸光度最大。为了保证酶的充分反应，应保证底物的适度过量[23]，因此反应体系底物PNPG的最适浓度为5 mmol/L。

如图1C所示，在底物浓度为5 mmol/L、反应时间为15 min时，体系吸光度与酶浓度（0～50 U/L）呈良好的线性关系（R2＝0.999），表明此时酶浓度与吸光度成正比，酶促反应速率恒定。

综上可知，α-葡萄糖苷酶催化PNPG的最佳反应条件：底物PNPG浓度为5 mmol/L，于37 ℃反应15 min，产物的吸光度约为0.2～0.4，α-葡萄糖苷酶浓度20～40 U/L。该结果与先前的报道结果[15,24]一致，说明反应体系可靠。

2.1.2 猪小肠不同部位的黏膜提取物的α-葡萄糖苷酶活力分析

2.1.2.1 猪小肠不同部位黏膜提取物的稀释倍数

图2 猪小肠黏膜提取物稀释不同倍数后的α-葡萄糖苷酶活力Fig. 2 α-Glucosidase activity from porcine small intestinal mucosal extracts diluted at different folds

图2 A为不同稀释倍数的猪十二指肠黏膜提取物与5 mmol/L α-葡萄糖苷酶底物（PNPG）在37 ℃下反应15 min后α-葡萄糖苷酶活力变化，十二指肠提取物稀释倍数的倒数与吸光度呈线性关系（y＝3.492 7x+0.034 5，R2＝0.997 8）。根据图1C可知，标准α-葡萄糖苷酶反应体系中，酶浓度为40 U/L时的吸光度为0.367，将0.367作为y值代入图2A中的公式，得到的x值即为相当于40 U/L标准酶的猪十二指肠黏膜提取物的稀释倍数。因此具有与40 U/L α-葡萄糖苷酶相同活力的猪十二指肠黏膜提取物的稀释倍数应为10.7 倍。

图2B表示稀释不同倍数猪空肠黏膜提取物与5 mmol/L α-葡萄糖苷酶底物（PNPG）在37 ℃下反应15 min后，体系的吸光度变化，稀释倍数倒数与吸光度呈线性关系（y＝5.106 4x+0.037 2，R2＝0.997 2）。在确定的最佳酶活力测定体系中，猪空肠黏膜提取物具有40 U/L α-葡萄糖苷酶活力时的稀释倍数为16.0 倍。

图2C表示稀释不同倍数猪回肠黏膜提取物与5 mmol/L底物在37 ℃下反应15 min，体系吸光度变化，吸光度与稀释倍数的倒数具有线性关系（y＝17.359 7x+0.044 1，R2＝0.998 9）。在确定的最佳酶活力测定体系中，猪空肠黏膜提取物具有40 U/L α-葡萄糖苷酶酶活力时的稀释倍数为54.7 倍。

通过观察，图2A～C中所得公式的斜率是依次增大的（3.492 7＜5.106 4＜17.359 7），说明猪十二指肠、猪空肠和猪回肠黏膜提取物中的α-葡萄糖苷酶活力依次升高，含量依次增多。当把3 个部位猪小肠黏膜提取物稀释到相当于标准酶40 U/L时，猪回肠黏膜提取物需要更大的稀释倍数（54.7），这也印证了上述结论。Zeng Zhu等[11]的研究中将猪小肠混合提取物稀释20 倍作为α-葡萄糖苷酶，但并未对具体细节作阐释。

2.1.2.2 猪小肠不同部位黏膜提取物的α-葡萄糖苷酶活力分析

表1 猪小肠不同部位黏膜提取物的α-葡萄糖苷酶活力比较Table 1 Comparison of α-glucosidase activity of porcine intestinal mucosal extracts

如表1所示，猪回肠黏膜提取物的α-葡萄糖苷酶比活力在3 种提取物中最高，为0.084 1 U/mg，大约是猪十二指肠的2 倍，猪空肠的4 倍，比较适于提取α-葡萄糖苷酶，作为α-葡萄糖苷酶抑制剂评价的材料。

2.1.3 α-葡萄糖苷酶活力抑制率的验证

图3 阿卡波糖对不同来源的α-葡萄糖苷酶的抑制率曲线Fig. 3 Inhibition curves of acarbose against α-glucosidase derived from yeast and porcine ileum

按照2.1.1节确定的酶促反应体系，分析不同质量浓度的阿卡波糖对酵母源和猪回肠源α-葡萄糖苷酶活力的抑制率。由图3A可知，阿卡波糖质量浓度为0.1～3.2 mg/mL时，抑制率与其质量浓度呈对数关系，这与Sudha等[25]的报道结果相吻合，且得到非线性拟合方程y＝21.075 6 ln x+47.946 0（R2＝0.997 0），阿卡波糖对酵母源α-葡萄糖苷酶的半数有效抑制质量浓度（median inhibition concentration，IC50）为（1.102 4±0.081 3）mg/mL。

由图3B可见，抑制率与阿卡波糖质量浓度（0.1～3.2 mg/mL）呈对数关系，拟合回归方程为y＝14.228 5 ln x+70.030 4（R2＝0.994 2），阿卡波糖对猪回肠源α-葡萄糖苷酶活力抑制的IC50为（0.244 7±0.025 6）mg/mL，明显低于对酵母源α-葡萄糖苷酶活力抑制的IC50，说明阿卡波糖对哺乳动物体内的α-葡萄糖苷酶具有更高的抑制活性，这与Önal等[26]的研究结果一致。选择哺乳动物源α-葡萄糖苷酶进行α-葡萄糖苷酶抑制物筛选更加客观、有效。

2.2 猪小肠不同部位黏膜提取物的DPP-4活力

2.2.1 DPP-4活力测定体系的建立

图4 DPP-4在不同酶促条件下的酶活力Fig. 4 DPP-4 activity under different enzymatic reaction conditions

利用商业化的由Sf9细胞中重组表达的DPP-4建立DPP-4活力测定体系，获得酶活力标准曲线，并以此为标准，确定不同部位猪小肠黏膜提取物的DPP-4活力。如图4A所示，当DPP4浓度为15 U/L，底物Gly-Pro-pNA浓度为1.5 mmol/L时，体系吸光度与反应时间关系呈抛物线形式。0～60 min内DPP-4与底物反应迅速，吸光度呈线性变化，说明DPP-4此时被充分反应。60 min后，吸光度变化放缓，说明底物的量已无法满足反应，60 min后吸光度无显著性变化（P＞0.05），因此确定60 min为最佳酶促反应时间。

如图4B所示，在酶浓度为15 U/L、反应时间为60 min时，体系吸光度与底物浓度呈现典型的抛物线形式，随着底物浓度的增加，吸光度增大，但增速放缓，当达到1.6 mmol/L时，反应体系中底物浓度趋于饱和，继续增加底物吸光度无显著性变化（P＞0.05）。因此反应体系确定底物Gly-Pro-pNA最适浓度为1.6 mmol/L。

如图4C所示，在底物浓度为1.6 mmol/L，反应60 min内，体系吸光度与酶浓度（0～20 U/L）呈良好的线性关系（R2＝0.999 6），表明反应时酶的量充足。

综上，确定DPP-4活力测定最佳反应条件为：DPP-4浓度5～15 U/L、底物Gly-Pro-pNA浓度1.6 mmol/L、37 ℃反应时间60 min。在最佳反应条件下，体系的吸光度约为0.1～0.4，这与先前的报道[17,27]一致，说明反应体系可靠。

2.2.2 猪小肠不同部位的黏膜提取物的DPP-4活力分析

2.2.2.1 猪小肠不同部位的黏膜提取物的稀释倍数

图5 猪小肠黏膜提取物稀释不同倍数后的DPP-4活力Fig. 5 DPP-4 activity of porcine small intestinal mucosal extracts diluted at different folds

图5 A表示稀释不同倍数的猪十二指肠提取物与1.6 mmol/L DPP-4底物在37 ℃下反应60 min后，DPP-4活力的变化。体系吸光度与猪十二指肠提取物的稀释倍数的倒数成正比（y＝4.107 9x+0.238 9，R2＝0.998 3）。根据已确定的DPP-4最佳反应体系，具有与15 U/L DPP-4相同酶活力时的猪十二指肠黏膜提取物的稀释倍数应为27.7 倍。

图5B表示稀释不同倍数的猪空肠黏膜提取物与1.6 mmol/L底物在37 ℃下反应60 min后的酶活力变化。体系吸光度与猪空肠提取物稀释倍数的倒数呈线性关系（y＝13.345 5x+0.004 2，R2＝0.995 3）。根据已确定的DPP-4最佳反应体系，具有与15 U/L DPP-4相同酶活力时的猪空肠黏膜提取物的稀释倍数应为35.1 倍。

图5C表示分别稀释不同倍数猪回肠黏膜提取物与1.6 mmol/L底物在37 ℃下反应60 min后的酶活力变化，体系吸光度与猪回肠提取物稀释倍数的倒数呈线性关系（y＝21.929 0x+0.145 8，R2＝0.997 8）。根据已确定的DPP-4最佳反应体系，具有与15 U/L DPP-4相同酶活力时的猪空肠黏膜提取物的稀释倍数应为91.7 倍。

通过观察，图5A～C中所得公式的斜率是依次增大的（4.107 9＜13.345 5＜21.929 0），说明十二指肠、空肠和回肠黏膜提取物中的DPP-4活力依次增加。当把3 种猪小肠黏膜提取物稀释到相当于标准酶15 U/L时，猪回肠黏膜提取物需要更大的稀释倍数（91.7），印证了上述结论。

2.2.2.2 猪小肠不同部位黏膜提取物的DPP-4活力分析

表2 猪小肠不同部位黏膜提取物的DPP-4活力比较Table 2 Comparison of DPP-4 activity of porcine intestinal mucosal extracts

如表2所示，在猪小肠不同部位中，猪回肠黏膜提取物的DPP-4比活力最高，为0.053 4 U/mg，说明在猪回肠中有更高浓度的DPP-4，猪回肠黏膜提取物比较适宜提取DPP-4和作为DPP-4抑制剂评价的材料。据报道，负责分泌GLP-1的肠黏膜L细胞主要分布在猪空肠和结肠中，而GLP-1是DPP-4的主要体内作用底物[28]，这一论点从侧面印证了猪回肠中DPP-4活力更高。

2.2.3 DPP-4活力抑制率的验证

按照2.2.1节确定的酶促反应体系，分析不同质量浓度的阳性对照IPI对细胞重组人源和猪回肠源DPP-4的抑制率。如图6A所示，IPI质量浓度在一定范围内（2～200 μg/mL）对DPP-4活力的抑制率与其质量浓度呈对数关系，这与Silveira等[29]的报道结果一致，非线性拟合得到方程y＝13.076 1 ln x+11.416 1（R2＝0.998 7），由此计算得到IPI对细胞重组人源DPP-4的IC50为19.119 7 μg/mL，与文献报道的结论[30]一致。当IPI质量浓度高于100 μg/mL时，抑制率大于70%。

图6 IPI对不同来源的DPP-4的抑制率曲线Fig. 6 Inhibition curves of IPI against DPP-4 derived from humans and porcine ileum

如图6B所示，猪回肠源DPP-4抑制率与IPI质量浓度呈对数关系，回归方程为y＝20.864 1 ln x-27.616 6（R2＝0.986 4）。IPI对猪回肠源DPP-4的IC50为41.268 4 μg/mL，比细胞重组人源DPP-4的IC50高，说明IPI对人源体内的DPP-4具有更高的抑制活性，也证明了猪回肠源DPP-4体系有效。

3 结 论

本实验对比分析了猪小肠不同部位的黏膜提取物α-葡萄糖苷酶和DPP-4的活力。在此基础上建立了猪小肠黏膜提取物作为α-葡萄糖苷酶和DPP-4的酶反应体系，最后利用这两种酶的阳性药（阿卡波糖和IPI）分别进行了抑制率验证和评价。在α-葡萄糖苷酶筛选体系中，阿卡波糖对商品和猪回肠源α-葡萄糖苷酶的IC50分别是1.102 4、0.244 7 mg/mL；在DPP-4筛选体系中，IPI对商品和猪回肠源DPP-4的IC50分别为19.119 7、41.268 4 μg/mL。结果表明猪回肠黏膜提取物表现出更高的α-葡萄糖苷酶和DPP-4比活力，分别为0.084 1、0.053 4 U/mg。因此猪回肠黏膜提取物更适合用于α-葡萄糖苷酶和DPP-4抑制剂的筛选。