VD3与大豆分离蛋白相互作用的多重光谱分析与计算

陈 爽，王小丹，李 瑞，孙洪蕊，王喜波,，江连洲

（1.东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.吉林省农业科学院，吉林 长春 130000）

VD3是VD的一种重要形式[1]，可以发挥调节钙磷代谢，促进骨骼的生长，预防佝偻病、甲亢、癌症、心血管疾病和增强免疫力等作用[2-4]。VD3是疏水性成分，不溶于水，对多种环境因素很敏感，在光、热和氧气的作用下，可以很快发生异构化，化学结构和生理功发生改变，因此将其直接加入到液体食物或饮料中是不可行的[5]。封装技术是提高其稳定性，保证其生物活性的理想方法[6]。近年来玉米醇溶蛋白、乳清分离蛋白、大豆分离蛋白（soy protein isolate，SPI）及多糖等作为VD3的保护物质，被普遍用于封装技术。Abbasi等[7]用超声辅助乳清分离蛋白对VD3进行封装，提高了VD3的水溶性和稳定性。Lee等[8]用pH值偏移和超声结合制备了SPI纳米颗粒并对VD3进行封装，提高了其抵抗紫外线的能力。目前已经有很多学者通过蛋白与VD3进行相互作用，对VD3进行保护，并取得一定进展，然而鲜有VD3与SPI相互作用的报道。

荧光光谱是一种被广泛用来探索蛋白质与外源小分子物质（药物、食品添加剂、表面活性剂、染料和持久性有机污染物等）相互作用的方法[9]。本实验运用荧光光谱详细研究VD3与SPI相互作用的重要信息，包括猝灭类型、表观结合常数、结合位点数、结合距离和作用力；运用同步荧光和紫外-可见光谱探究VD3对SPI结构中色氨酸残基和酪氨酸残基微观环境的影响；运用傅里叶变换红外光谱研究VD3对SPI二级结构的影响。本实验进一步验证VD3与SPI相互作用的存在，为提高VD3水溶性，制备出负载率高、稳定性强的SPI-VD3纳米颗粒，扩大VD3应用范围提供理论依据，也为开发新的大豆蛋白产品提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

VD3（纯度＞99%） 美国Sigma公司；低温脱脂豆粕 山东禹王实业有限公司；乙醇 天津市外环化工有限公司；实验中所用试剂均为分析纯；所用水为去离子水。

1.2 仪器与设备

粉碎机 中德中药机械有限公司；N24120型电子天平 瑞士Ohaus公司；ALC-310.3型分析天平 德国ACCULAB公司；GL-21M型冷冻离心机 长沙湘智离心机仪器有限公司；ALPHA 1-4 LSC型冷冻干燥机 德国Christ公司；UV-240IPC型紫外分光光度计、FTIR-8400S型傅里叶变换红外光谱仪 日本岛津公司；F-4500型荧光分光光度计 日本日立公司；79-1型磁力加热搅拌器金坛市双捷实验仪器厂；HH-4型数显搅拌水浴锅 常州塞浦实验仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 SPI的制备

根据Sorgentini等[10]描述的方法略作改动制备SPI。将脱脂豆粕粉碎过60 目筛得到脱脂豆粉。将脱脂豆粉经碱溶酸沉法制得SPI沉淀物。将沉淀物用去离子水复溶，洗涤两次以除去残留其中的盐离子，然后用2 mol/L NaOH溶液将其pH值调至7.0。通过冷冻干燥机将其进行干燥获得SPI粉末，将其贮存于-20 ℃冰箱中备用。测得其蛋白质量分数为90.12%。

1.3.2 VD3溶液的制备

为避免VD3降解，以下操作均在避光条件下进行。称取一定VD3粉末溶于无水乙醇，磁力搅拌以保证其完全溶于乙醇，之后将其稀释到不同浓度，置于棕色瓶中备用。每次实验前需重新配制VD3溶液。

1.3.3 SPI-VD3溶液制备

将SPI粉末溶于磷酸盐缓冲液（0.01 mol/L、pH 7.0）搅拌4 h配制成4 mg/mL的SPI溶液，备用。

1.3.4 荧光光谱分析

向10 mL SPI溶液（4 mg/mL）中逐渐滴加100 μL不同浓度的VD3溶液，使其中VD3终浓度分别为2.0×10-6、4.0×10-6、6.0×10-6、8.0×10-6、1.0×10-5mol/L，用漩涡振荡器使其混合均匀，以制备SPI-VD3复合体系，并分别记为SPI-VD3-1～SPI-VD3-5。分别在293、298、306 K的水浴锅中保温10 min。设置激发波长为290 nm，发射波长范围为300～460 nm，激发狭缝为5 nm，扫描速率为12 000 nm/min，电压为700 mV，测定内源荧光。同步荧光光谱扫描中，室温条件下，分别固定Δλ＝15 nm和Δλ＝60 nm（Δλ＝激发波长-发射波长）进行扫描。

1.3.5 紫外-可见吸收光谱分析

以无水乙醇作空白，测定VD3及各样品在200～500 nm波长范围内的紫外-可见吸收光谱。

1.3.6 傅里叶变换红外光谱分析

将SPI溶液和SPI与VD3混合溶液（SPI质量浓度为4 mg/mL，VD3质量浓度为0.8 mg/mL）冷冻干燥，将1 mg冷冻干燥后的样品与150 mg KBr粉末混合研磨，然后在6～8 T压力下将混合粉末压制成固体薄片，以用于傅里叶变换红外光谱测定。使用FTIR-8400S型傅里叶变换红外光谱仪进行全波段（4 000～400 cm-1）扫描，设置分辨率为4 cm-1，扫描次数为32 次。

1.4 数据统计与分析

每组数据均重复3 次，数据均用SPSS 17.0软件通过方差分析进行差异显著性分析，采用Origin 8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 VD3对SPI内源荧光光谱的影响

蛋白质的内源荧光主要依赖于色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）这3 种具有苯环结构或共轭双键的氨基酸。在激发波长为290 nm时，主要反映了色氨酸和酪氨酸的荧光光谱，苯丙氨酸的作用很弱可以忽略[11]。如图1所示，VD3的加入使SPI的荧光强度降低，且VD3添加量越多，荧光强度越低，这说明VD3对SPI产生了荧光猝灭，且VD3含量越高，猝灭效果越强。同时发现SPI的最大荧光发射波长从360.2 nm红移至362.8 nm，红移了2.6 nm。这可能是因为VD3的存在导致SPI空间结构发生改变，SPI的发色基团酪氨酸残基和色氨酸残基的微环境由疏水环境向亲水环境转变，蛋白分子解折叠使SPI分子的三级结构更加舒展，内部色氨酸残基被遮蔽因而使SPI荧光发生猝灭[12]。

图1 VD3对SPI内源荧光光谱的影响Fig. 1 Effect of VD3 on the fluorescence intensity of SPI

2.2 VD3-SPI复合物的结合常数、结合位点数

荧光猝灭有两种作用机制，即动态猝灭和静态猝灭[13]。若荧光猝灭是由猝灭剂与基态荧光通过弱的作用力形成复合物导致，即静态猝灭。若荧光猝灭仅是由于猝灭剂与激发态荧光分子碰撞导致的，则为动态猝灭[14]。猝灭类型可以用Stern-Volmer方程[15]进行判断，如公式（1）所示。

式中：F0为未加入猝灭剂VD3时SPI的荧光强度；F为加入猝灭剂VD3后SPI的荧光强度；Ksv为动态猝灭常数/（L/mol）；[Q]为VD3的浓度/（mol/L）；Kq为双分子猝灭速率常数/（L/（mol·s））；τ0为不添加猝灭剂时荧光体的寿命/s，蛋白的平均寿命约为10-8s

根据Stern-Volmer方程，以[Q]为自变量、F0/F为因变量作图。VD3-SPI复合物的Ksv和Kq均可根据图中拟合的直线斜率计算，结果见表1。对于动态猝灭，温度升高会增加离子有效碰撞的数目，促进电子的转移，使荧光物质的猝灭常数增大；而对于静态猝灭，随着温度升高，荧光物质与小分子形成的复合物稳定性下降，使荧光物质的猝灭常数逐渐减小[16]。本实验选择293、298 K和306 K 3 个温度，以确定猝灭常数随温度的变化趋势，进而确定VD3对SPI的猝灭类型。

由图2可知，本实验中，VD3对SPI的Stern-Volmer曲线均呈现一定的线性关系，且直线的斜率随温度升高而减小，即猝灭常数随温度的升高而减小，因此VD3对SPI的猝灭为静态猝灭。猝灭剂对于生物大分子最大猝灭速率常数一般为2×1010L/（mol·s）[17]，而VD3对SPI的猝灭常数数量级为1012（表1），远远高于1010，这进一步确定该猝灭是由VD3与SPI结合形成化合物产生的是静态猝灭。

表1 SPI-VD3复合物的荧光猝灭常数及线性相关系数Table 1 Quenching rate constants and correlation coefficients of SPI-VD3 complex

图2 不同温度条件下VD3猝灭SPI的Stern-Volmer图Fig. 2 Stern-Volmer plots of SPI quenching by VD3 at different temperatures

对于静态猝灭，结合常数KA和结合位点数n可由式（2）计算。

式中：F0为未加入猝灭剂VD3时SPI的荧光强度；F为加入VD3猝灭剂后SPI的荧光强度；KA为表观结合常数；n为结合位点数；[Q]为猝灭剂的浓度/（mol/L）。

根据公式（2），以lg[Q]为自变量、lg（（F0－F））/F）为因变量作图，将散点图进行线性拟合得到图3，3 个不同温度下VD3与SPI相互作用的结合位点数n和表观结合常数KA均可根据直线的斜率和截距计算得出（表2）。从表2可以看出，VD3与SPI间的表观结合常KA数量级为104，这表明VD3与SPI在293、298、306 K这3 个温度点都发生了紧密的结合。当温度由293 K升高到306 K时，结合位点数由0.973 3升高到1.094 2，均接近1，其受温度影响不明显。

图3 不同温度条件下VD3猝灭SPI的双对数曲线Fig. 3 Double logarithmic curves of SPI quenching by VD3 at different temperatures

表2 SPI-VD3复合物的结合位点数、表观结合常数及线性相关系数Table 2 Apparent binding constants, binding site numbers and correlation coefficients of SPI-VD3 complex

2.3 VD3与SPI相互作用的热力学参数及作用力

通常小分子与蛋白质之间的相互作用力有4 种，即氢键、静电作用、范德华力和疏水作用力。Ross等[18]提出药物小分子与蛋白质之间的主要作用力类型可根据反应前后体系的热力学参数焓变ΔH和熵变ΔS的相对大小进行判断。当ΔH＞0、ΔS＜0时，分子间作用力主要是静电引力和疏水作用力；当ΔH＞0、ΔS＞0时，分子间的主要作用力为疏水作用力；当ΔH＜0、ΔS＜0时，分子间作用力主要是范德华力、氢键或质子化等作用；当ΔH＜0、ΔS＞0时，分子间作用力主要是静电引力[19]。本实验中温度相差不大，因此焓变可视为常数[20]。可由Van't Hoff方程计算出焓变ΔH、熵变ΔS和吉布斯自由能ΔG的数值并判定VD3与SPI之间的作用力类型。

式中：K为在相应温度下体系的结合常数；R为理想气体常数8.314 J/（mol·K）；ΔG为吉布斯自由能/（kJ/mol）；ΔH为焓变/（kJ/mol）；ΔS为熵变/（J/（mol·K））。

通过计算得大豆蛋白与VD3相互作用的焓变ΔH、熵变ΔS和吉布斯自由能ΔG，如表3所示。

表3 VD3与SPI结合的相关热力学参数Table 3 Thermodynamic parameters for interaction between VD3 and SPI

由表3可知，ΔG＜0、ΔH＞0，表明VD3与SPI之间的相互作用为自发进行的吸热反应，温度升高，将有利于反应的进行，该结果与结合常数KA随着温度升高而增大的变化趋势相一致，进一步确定VD3与SPI是一个吸热过程。由ΔH＞0和ΔS＜0可说明静电引力和疏水相互作用是使VD3与SPI形成复合物的主要作用力。

2.4 VD3与SPI的结合距离

对于药物小分子物质与蛋白形成的复合物，结合位置与蛋白质分子中荧光基团之间的距离可根据Förster[21]理论计算得出。结合位置与蛋白质分子中荧光基团距离越近，蛋白质越容易储存与运输药物小分子，药物小分子则能更好地发挥其药理作用[22]。由图4可发现，SPI的荧光光谱与VD3的紫外吸收光谱发生了重叠，此时SPI与VD3之间发生非辐射能量转移。各物理量符合式（6）、（7）关系。

图4 SPI的荧光光谱与VD3的紫外吸收光谱的重叠光谱Fig. 4 Overlap of fluorescence spectrum of SPI with absorption spectrum of VD3

式中：E为能量转移效率；R0为E为50%时临界距离（福斯特距离）/nm；r为供体与受体的结合距离/nm。

式中：K为供体和受体各项随机分布的取向因子，本实验中取K2为2/3；n为介质折射指数，取水和有机物平均值1.336；ΦD为给体的荧光量子产率，取值0.15；J为供体的发射光谱与受体的紫外吸收光谱二者重叠积分（式（8））。

式中：FD（）为供体在 至+d波数间隔内的校正荧光强度，荧光总强度归一化为1；εA（）为受体在波数 的摩尔吸光系数/（L/（mol·cm））。

能量转移效率E可用公式（9）计算。

根据图4的光谱图求出积分J，并确定E、K2和n，则R0和r均可被求出。

图4为SPI的荧光光谱和VD3的紫外吸收光谱，先将荧光总强度归一化为1，然后将光谱重叠部分分割成极小的矩形，通过式（8）求得重叠积分J（ν）＝8.84×10-15。

在上述实验条件下，将K2＝2/3、n＝1.336、ΦD＝0.15和J（ν）＝8.84×10-15代入式（7），求得临界距离R0＝2.50 nm。再将F＝844、F0＝606带入式（9）计算得到能量转移效率E＝0.282。经式（6）求得VD3距色氨酸残基的最短距离r＝2.92 nm。已知临界距离最大范围是5～10 nm，给体和受体间结合最大距离范围是7～10 nm[23]，R0＜5 nm，r＜7 nm说明VD3与SPI足够靠近，其结合是通过非辐射能力转移而促使蛋白质的荧光猝灭。

2.5 VD3与SPI相互作用的同步荧光光谱分析结果

由于同步荧光光谱的最大发射波长的红移或蓝移可以反映氨基酸残基周围微环境的极性变化，其常被用于研究蛋白质与药物分子之间相互作用[24]。分别固定激发和发射单色器的波长差Δλ＝15 nm和Δλ＝60 nm，进行同步荧光光谱扫描，可得到反映酪氨酸残基和色氨酸残基微观环境变化的荧光特征光谱[25]。

图5 SPI-VD3体系的同步荧光光谱Fig. 5 Synchronous fluorescence spectra of SPI-VD3 at room temperature

由图5可知，随着VD3含量的增加，两个同步荧光光谱图的荧光强度均降低，且其最大吸收波长均有红移。酪氨酸残基（Δλ＝15 nm）的最大吸收波长由300 nm红移至301 nm，红移1 nm，色氨酸残基（Δλ＝60 nm）最大吸收波长由294 nm红移至294.6 nm，红移0.6 nm。该结果说明VD3与SPI相互作用使酪氨酸残基和色氨酸残基周围的疏水环境减弱，导致SPI构象发生改变且酪氨酸残基的红移距离比色氨酸的大，VD3与SPI的结合位点更接近酪氨酸残基[26]。

2.6 VD3与SPI相互作用的紫外-可见光谱分析结果

紫外-可见吸收光谱法是用于表征蛋白质结构变化及蛋白质-小分子复合物相互作用的常用方法之一。一般来说，峰强度变化大小与两者相互作用强弱有关，而峰位的改变通常是因为小分子与蛋白质相互作用使生色团周围微环境改变[27]。图6显示了不同浓度VD3对SPI紫外-可见吸收光谱的影响，随着VD3浓度的增加，SPI的紫外-可见光吸收光谱吸光度逐渐增强，最大吸收峰波长由259 nm红移至262 nm，红移了3.0 nm。说明VD3与SPI发生了相互作用，使SPI芳香族氨基酸所处的微环境发生了变化，VD3诱导SPI肽链伸展，造成了SPI构象发生改变，进而增强了吸光度。

图6 VD3对SPI紫外-可见吸收光谱的影响Fig. 6 Effect of VD3 on the UV-Vis absorption spectrum of SPI

2.7 VD3与SPI相互作用的傅里叶变换红外光谱分析结果

图7 VD3对SPI傅里叶变换红外光谱的影响Fig. 7 Effect of VD3 on the Fourier transform infrared spectrum of SPI

傅里叶变换红外光谱法是一种研究蛋白质二级结构构象变化的常用技术[28]。其中在酰胺I区（1 700～1 600 cm-1，主要是C＝O伸缩）和酰胺II区（1 600～1 500 cm-1，C—N伸缩振动和N—H弯曲振动）范围内红外吸收峰的变化可以反映蛋白质二级结构的变化[29]。由图7可知，VD3加入后降低了酰胺I区和酰胺II区的透光率，且均使酰胺I区和酰胺II区发生了不同程度的红移。VD3的加入引起SPI酰胺I区从1 632.93 cm-1蓝移至1 631.96 cm-1，酰胺II区从1 531.28 cm-1红移至1 533.13 cm-1，说明VD3使SPI的二级结构发生了变化。

3 结 论

本实验通过荧光光谱法研究了VD3与SPI之间的相互作用，发现VD3会与SPI结合产生复合物而造成静态猝灭，在3 个温度下均形成了结合位点接近1的复合物，VD3与SPI之间有较强的结合作用，结合时通过非辐射能力转移而促使蛋白质的荧光猝灭。二者之间的反应为自发的吸热反应，作用力主要为静电相互作用和疏水相互作用。VD3的加入使荧光光谱、同步荧光光谱和紫外-可见光谱中样品的最大吸收波长均发生红移，表明SPI中芳香族氨基酸色氨酸残基和赖氨酸残基所处的微观环境发生改变，使SPI的分子构象发生改变，SPI肽链更加延展。傅里叶变换红外光谱表明VD3引起SPI的二级结构发生改变。