贝达喹啉、氯法齐明和德拉马尼对常见致病性非结核分枝杆菌体外抑菌活性及耐药机制的研究进展

孙晴 黄海荣 王桂荣

非结核分枝杆菌(non-tuberculous mycobacteria,NTM)系指除结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌。NTM常存在于自然环境中，为机会性致病菌。近年来， NTM 引起的感染呈逐渐上升趋势，严重威胁人类健康[1-2]。NTM感染肺、淋巴结、皮肤等器官和组织的疾病称为NTM病，以肺部受感染多见。NTM病往往作为继发性或伴随性疾病，患者通常伴随慢性基础疾病或免疫系统的损害，如患有慢性阻塞性肺疾病(COPD)、恶性肿瘤、艾滋病(AIDS)等疾病。NTM病在临床表现及影像学、实验室检查结果等方面与结核病相比无明显差异，但二者的治疗方案却大相径庭。此外，NTM致病的菌种繁多，不同菌种NTM对药品的敏感性不同，针对不同菌种引起的NTM病的治疗方案也存在较大差异。因此寻找对NTM治疗效果较佳的药品非常有必要。近年来，贝达喹啉(bedaquiline,Bdq)、氯法齐明(clofazimine，Cfz)及德拉马尼(delamanid，Dlm)因对治疗NTM病体现出了良好的治疗潜力而受到广泛关注。

虽然NTM种属分布常具有地域特点，不同国家、地区报道的NTM菌种组成、菌种构成比例多存在明显差异，但在多数地区鸟-胞内分枝杆菌复合群(M.aviumcomplex,MAC)、脓肿分枝杆菌(M.abscessus)和堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)为较常见的致病菌种。笔者将围绕Bdq、Cfz和Dlm对常见致病性NTM的体外抑菌活性及耐药相关机制进行综述。

Bdq对常见致病性NTM的体外抑菌活性及耐药机制

Bdq是近40 多年来第一个上市的抗结核新药，属于二芳基喹啉类化合物。Bdq是一种三磷酸腺苷(ATP)合成酶抑制剂，通过与分枝杆菌的ATP合成酶C亚基结合，影响ATP合成酶质子泵生物学功能，导致ATP耗竭和内环境稳态失衡，从而达到抑菌或杀菌效果[3]。2012年经美国食品与药品管理局批准，Bdq可用于治疗耐多药结核病(MDR-TB)和广泛耐药结核病(XDR-TB)[4]。因Bdq对治疗NTM病体现出了良好的治疗潜力而受到广泛关注。

一、Bdq对NTM的体外抑菌活性

《伯杰氏系统细菌学手册》根据NTM的生长速度将其分为快速生长分枝杆菌(rapid growing mycobacterium,RGM)和缓慢生长分枝杆菌(slow growing mycobacterium,SGM)。Bdq为刚上市不久的新药，美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute)或世界卫生组织(World Health Organization，WHO)还未界定Bdq对NTM的耐药临界值。Yu等[5]的研究建议Bdq对NTM(包括RGM和SGM)的流行病学临界(epidemiological cut-off，ECOFF)平均值应为2 μg/ml；Pang等[6]建议Bdq对RGM的ECOFF为2 μg/ml，对SGM的ECOFF为1 μg/ml。

Yu等[5]的研究显示，Bdq对SGM和RGM的绝大部分标准株具有很强的体外抑菌活性，但对SGM的抑菌活性要强于RGM；对于常见的致病性NTM临床分离株，Bdq也体现出了良好的体外抑菌活性。Bdq对MAC和M.kansasii临床分离株均具有较强的抑菌活性，抑制50%细菌生长的最低药物浓度(MIC50)和抑制90%细菌生长的最低药物浓度(MIC90)值均在较低水平。Kim等[7]的研究结果显示，MAC和M.kansasii临床分离株对Bdq的MIC50和MIC90均为0.016 μg/ml。Pang等[6]的研究结果表明，MAC临床分离株对Bdq的 MIC50和MIC90分别为0.03 mg/L和≥16 mg/L；M.kansasii临床分离株对Bdq的 MIC50和MIC90分别为0.06 mg/L和>16 mg/L。DeStefano等[8]的研究结果显示，M.kansasii临床分离株对Bdq的 MIC50和MIC90分别为0.06 μg/ml和>16 μg/ml。Brown-Elliott等[9]的结果显示，MAC临床分离株对Bdq的 MIC50和MIC90分别为≤0.008 μg/ml和0.015 μg/ml。

另外，Bdq对M.abscessus临床分离株也有良好的体外抑菌效果，但要弱于对M.kansasii和MAC临床分离株的体外抑菌效果。Kim等[7]的研究结果显示，M.abscessus临床分离株对Bdq的 MIC50和MIC90分别为0.062 μg/ml和0.125 μg/ml。Pang等[6]的研究结果表明，M.abscessus临床分离株对Bdq的 MIC50和MIC90分别为0.13 mg/L和>16 mg/L。Li等[10]的研究结果显示，M.abscessus临床分离株对Bdq的MIC50和MIC90分别为0.062 mg/L和0.125 mg/L。Yu等[5]的研究结果显示，M.abscessus临床分离株对Bdq的MIC90为2 μg/ml。Dupont等[11]的研究结果表明，在斑马鱼体内Bdq对M.abscessus依然有着良好的抑菌效果。

可见，Bdq在体外对缓慢生长的MAC和M.kansasii临床分离株，以及快速生长的M.abscessus临床分离株均表现出了良好的抑菌效果。

二、 NTM对Bdq耐药的相关机制

尽管Bdq对MDR-TB和XDR-TB具有良好的治疗效果，但仍存在耐药问题。结核分枝杆菌对Bdq的耐药主要存在以下几种机制：atpE基因突变、Rv0678基因突变和pepQ(Rv2535c)基因突变[12]。研究显示，NTM对Bdq的耐药机制与结核分枝杆菌大体相似，却又不尽相同，大致总结为以下几种。

1.atpE基因突变：atpE基因编码ATP合成酶的C亚基，是Bdq的主要靶点。耐药菌株可以阻止Bdq与C亚基结合，从而阻断Bdq的抗菌作用。Andries等[13]研究发现，耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)atpE基因发生了D32V突变。Aguilar-Ayala等[14]在对atpE基因序列测定时发现其63位丙氨酸转变为蛋氨酸，这很可能是微黄分枝杆菌(M.flavescens)对Bdq 产生天然抗性的原因。Dupont等[11]在M.abscessus中对atpE基因进行单点突变时发现D29V和A64P会导致Bdq高抗性。

2.Rv0678同源基因突变：在结核分枝杆菌中，Rv0678是mmpL转导系统的负调控因子，Rv0678突变可导致编码mmpS5-mmpL5外排泵基因表达上调，从而使结核分枝杆菌对Bdq产生耐药[15]。Li等[10]在对Bdq耐药的M.abscessus中发现Rv0678的同源基因Mab_4383/Mab_4382和Mab_4384存在突变，导致mmpS5-mmpL5过表达；另外Mab_4384的缺失也会导致Bdq耐药。

3.mmpT5突变：在M.intracellulare中mmpT5与mmpR5(Rv0678)作用相似，都编码转录调节因子，调控mmpS5-mmpL5外排泵基因的表达。Alexander等[16]的研究认为，移码突变导致了mmpT5功能丧失，与M.intracellulare对Bdq的低水平耐药相关。

4.Mab_2299c突变：Mab_2299c属于TetR转录调节子家族，通过调控Mab_2300/Mab_2301，进而调控mmpS/mmpL外排泵系统。Richard等[17]研究发现，在M.abscessus中Mab_2299c突变与对Bdq耐药相关，也与对Bdq和Cfz产生交叉耐药相关。

Cfz对常见致病性NTM的体外抑菌活性及耐药机制

Cfz是 20 世纪 40 年代研制的抗分枝杆菌药品，主要用于麻风病的治疗，近年来开始用于治疗MDR-TB。目前Cfz抑菌的作用机制尚不清楚，分枝杆菌的外膜似乎是Cfz作用的主要靶点[18]。

一、Cfz对NTM的体外抑菌活性

Luo等[19]和Li等[20]对NTM标准株的研究结果显示，Cfz对SGM的体外抑菌活性要强于RGM。Cfz对不同NTM临床分离株的体外抑菌活性差异较大，Cfz对M.kansasii临床分离株的体外抑菌活性最强，而对M.abscessus和M.fortuitum临床分离株的体外抑菌活性较差。Luo等[19]的研究结果表明，91%(41/45)的M.kansasii临床分离株对Cfz的MIC为0.031 μg/ml；Cfz对M.avium和M.intracellulare临床分离株的抑菌活性也较好，ECOFF分别为1 μg/ml和2 μg/ml；而M.abscessus和M.fortuitum临床分离株对Cfz的MIC90值均约为8 μg/ml。van Ingen等[21]的研究表明，M.kansasii和MAC临床分离株对Cfz的MIC中位值均较低(分别为MIC≤0.5 mg/L、MIC=1 mg/L)；M.abscessus和M.fortuitum临床分离株对Cfz的平均MIC值较高，分别为5 mg/L和2 mg/L。Shen等[22]的研究表明，M.abscessus临床分离株对Cfz的耐药率高达95%(19/20)，MIC90为32 μg/ml，而M.fortuitum耐药率为59%(10/17)，MIC90为0.25 μg/ml。Huang等[23]的研究显示，97.3%(73/75)的M.intracellulare临床分离株对Cfz敏感；62.5%(5/8)的M.abscessus临床分离株对Cfz耐药。但Shen 等[24]的研究结果显示，Cfz对M.abscessus和M.fortuitum临床分离株具有较强的抑菌活性，99.1%(116/117) 的M.abscessus和91.7%(44/48)的M.fortuitum临床分离株对Cfz的 MIC≤1 mg/L。

这些研究的结论并不完全一致，可能与选择的菌株数量、菌株来源不同有一定关系。此外，还有学者认为可能是由于存在交叉耐药，在结核分枝杆菌中发现，Rv0678基因突变可导致对Bdq耐药的菌株发生对Cfz的交叉耐药[25]。而Luo等[19]也在NTM中发现了相似的交叉耐药现象。

二、NTM对Cfz耐药的相关机制

结核分枝杆菌对Cfz耐药的机制主要有以下几种：Rv0678基因突变、Rv1979c突变和pepQ(Rv2535c)突变[12]。但在NTM中目前仅报道有Rv0678同源基因突变和Mab_2299c突变。

1.Rv0678同源基因突变：Luo等[19]研究发现，M.intracellulare对Cfz 耐药与Rv0678同源基因Asp92Glu和Ala153Pro突变有关，研究者通过Rv0678同源蛋白序列的对比，认为在M.intracellulare中92和153位点是两处高度保守的位点，并认为对Bdq与Cfz 的交叉耐药也与这两处位点突变有关。

2.Mab_2299c、Mab_1483、Mab_0540突变：Chen等[26]发现，在M.abscessus中Mab_2299c、Mab_1483、Mab_0540突变会导致对Cfz耐药。Mab_2299c是结核分枝杆菌Rv0452的同源基因，该基因调控外排泵mmpL4-mmpS4，是AcrR家族负转录调控因子。Rv0452和mmpL4-mmpS4在结核分枝杆菌中的组织结构与Rv0678和mmpL5-mmpS5相同，因此Mab_2299c的突变极有可能引起对Cfz耐药。此外，该学者还在29株对Cfz耐药的M.abscessus中发现，21株发生Mab_1483突变、16株发生Mab_0540突变，Mab_1483、Mab_0540被认为与对Cfz低水平耐药有关。以上结论与Richard等[17]在M.abscessus中对Mab_2299c的研究成果高度相近。

Dlm对常见致病性NTM的体外抑菌活性及耐药机制

2014年4月Dlm被欧洲药品管理局人用药品委员会批准为抗结核新药。Dlm是经过结构改造后的硝基咪唑类衍生物，其作用机制是通过抑制分枝菌酸的合成而抑制细胞壁的生物合成[27]。

一、Dlm对NTM的体外抑菌活性

研究发现Dlm对M.kansasii临床分离株表现出了很强的抑菌活性，而对其他NTM菌种，Dlm的抑菌活性似乎较差。Yu等[5]的研究发现，45株M.kansasii临床分离株中有39株对Dlm的MIC为0.125 μg/ml；Kim等[7]的研究中，M.kansasii临床分离株对Dlm的MIC50和MIC90分别为0.25 μg/ml和1 μg/ml，而MAC、M.abscessus临床分离株对Dlm的MIC值很高，对MAC的MIC50和MIC90分别为8 μg/ml和>16 μg/ml，对M.abscessus临床分离株的MIC50和MIC90均>16 μg/ml。Yu等[5]的研究也同样表明，Dlm对M.intracellulare和M.abscessus临床分离株几乎没有抑菌活性，对M.avium临床分离株的抑制活性也较差：91.7%(33/36)的M.intracellulare临床分离株、92.5%(37/40)的M.abscessus临床分离株MIC值>32 μg/ml，54.5%(12/22)的M.avium临床分离株MIC值>32 μg/ml。此外，Yu等[5]还发现，M.fortuitum临床分离株对Dlm 100%耐药(33/33)，MIC>32 μg/ml。

二、NTM对Dlm耐药的相关机制

在结核分枝杆菌中ddn、fgd1、fbiA、fbiB和fbiC基因被报道与Dlm耐药相关，Dlm经F420依赖性分枝杆菌硝基还原酶还原成其活性形式，F420随后通过6-磷酸葡萄糖脱氢酶循环还原为还原形式，其中F420由fbiA、fbiB和fbiC基因编码合成，而该还原酶由ddn(Rv3547)编码，脱氢酶由fgd1(Rv0407)编码[28-29]。

Yu等[5]在一株M.avium中发现ddn基因Thr79Arg和Ser86Cys 位点突变，被认为与产生对Dlm耐药相关。其他基因突变目前在NTM中还未见报道。

小 结

大环内酯类药品(以克拉霉素和阿奇霉素为主)被认为是治疗MAC、M.kansasii的重要药品[30-33]。治疗上通常推荐克拉霉素或阿奇霉素为主的2种以上药品治疗，如乙胺丁醇、利福平、利福布汀等[34]。但是仍有部分患者出现对一线药品不耐受，对大环内酯类药品产生耐药、治疗失败等情况。Cfz则可作为一种有潜力的补充性药品，与一线药品联用可达到较好的抑菌效果。目前，有学者推荐在治疗MAC时将利福平+大环内酯类药品+乙胺丁醇这一组合换成Cfz+大环内酯类药品+乙胺丁醇[35]。Jarand等[36]在对MAC感染患者进行随访后，也发现Cfz+大环内酯类药品+乙胺丁醇这一组合治疗效果更优；即使用Cfz+大环内酯类药品+乙胺丁醇治疗的患者较使用利福平+大环内酯类药品+乙胺丁醇的患者痰培养阳性转为阴性的阴转率更高[100%(90/90)和 71%(10/14)；P=0.0002]。

大环内酯类药品对MAC、M.kansasii等的抑菌效果良好，但对M.abscessus的体外抑菌活性较差[37-38]。有学者推荐在治疗M.abscessus时应在阿米卡星、头孢西丁、亚胺培南、替加环素、利奈唑胺中选择3或4种药品进行联合治疗[35]。尽管阿米卡星、头孢西丁等药品对M.abscessus有良好的抑菌效果[33,39-42]，但Cfz仍是一种有潜力的治疗药品。一些体外研究发现，当联用Cfz+阿米卡星或Cfz+克拉霉素时，对M.abscessus临床分离株有很强的抑菌效果：Shen等[24]发现，当Cfz与阿米卡星联用时，100%(40/40)的M.abscessus临床分离株对Cfz 的MIC值由原来的0.25～0.5 mg/L下降到<0.03125 mg/L。Ferro等[43]的研究结果表明，在治疗时使用Cfz+克拉霉素或Cfz+阿米卡星联用，比单一使用克拉霉素或阿卡米星的目标达成率高60%以上；在对M.abscessus感染进行治疗时，Cfz的使用可以抑制单独使用克拉霉素或阿卡米星治疗时的复发。以上2位学者均认为Cfz和阿米卡星、克拉霉素之间存在着协同作用。Yang等[44]的临床试验结果显示，Cfz和大环内酯类药品联合使用时，81%(34/42)的M.abscessus患者临床症状好转，31%(13/42)的M.abscessus患者影像学复查结果有所好转，24%(10/42)的M.abscessus患者实现了痰培养阴转。

展 望

近年来，Bdq、Cfz及Dlm因对NTM病体现出了良好的治疗潜力而受到广泛关注。继续研究NTM对Bdq、Cfz和Dlm的药物敏感性试验是十分重要的，可为未来设立不同菌株对Bdq、Cfz和Dlm体外药物敏感性试验折点奠定相关基础。此外，关于Bdq、Dlm对NTM病治疗效果的临床试验较少，还需进行更多的研究和探索。在临床上继续探索Cfz与不同药品的联用方式及研究各药品之间的相互作用，以便筛选最优联用组合是非常重要的。在耐药相关机制方面，一方面还需对已报道的耐药相关基因进行验证，另一方面则需要继续探索新的与耐药产生的相关机制。