血小板反应蛋白1与缺血性卒中

崔柳平， 马 迪， 陈 盈综述， 邢英琦审校

新生血管是导致动脉粥样硬化斑块破裂的重要原因，斑块破裂后出血，血小板聚集到病变处形成血栓，加重脑血管狭窄；此外，大动脉粥样硬化病变脱落的栓子可堵塞远端脑血管。脑组织对缺血性卒中的急性反应是复杂的。首先，活性氧(reactive oxygen species，ROS)增加引起氧化应激，氧化应激在缺血性卒中及脑缺血再灌注损伤的发病机制中起着至关重要的作用，ROS通过上调炎症介质和激活基质金属蛋白酶引起血脑屏障破坏；血脑屏障的破坏促进免疫细胞向脑组织迁移[1]。缺血性卒中发作后数分钟至数小时，迁移到脑组织的免疫细胞和脑组织中的小胶质细胞活化引发一系列炎症反应[2]；缺血后导致继发性脑损伤和神经元死亡，产生炎性介质，进一步扩大炎症反应。最新观点认为，缺血性卒中后脑内炎症不会局限于缺血灶周围，而会向全脑扩散并长期存在，持久的全脑炎症可能会导致慢性神经退行性变并影响卒中后的全脑功能[3，4]。近年来越来越多的文献报道，仅保存神经元可能不足以治疗卒中，最佳的卒中疗法应包括神经血管单位中所有细胞类型之间的功能相互作用[5]，包括神经元、血管系统和神经胶质成分，针对氧化应激、炎症反应以及胶质细胞的修复进行综合治疗。

已经证实，发生缺血性卒中后血小板反应蛋白1(thrombospondin-1，TSP-1)水平升高，是预测缺血性卒中不良预后的独立预测因子[6]，而且TSP-1影响氧化应激、炎症反应以及星形胶质细胞对神经元的修复作用，TSP-1在缺血性卒中以及神经损伤中起重要作用。

1 血小板反应蛋白1的结构及功能

TSP-1由三条多肽链组成，通过二硫键相连，是一种总分子量接近450 kDa同源三聚体糖蛋白；最初在血小板α颗粒中被发现，在激活时从血小板释放；后发现它存在于许多细胞类型，如内皮细胞、血管平滑肌细胞和免疫细胞(包括巨噬细胞和T细胞)等。TSP-1分泌到细胞外发挥作用，通过多种细胞表面受体(例如整合素、CD36、CD47、肝素硫酸蛋白聚糖、低密度脂蛋白相关蛋白和极低密度脂蛋白受体)与细胞相互作用而调节细胞功能，对血管生成、细胞增殖、趋化粘附、迁移存活、神经元修复和免疫调节发挥多种作用[7，8]。

TSP-1在生理情况下表达量极低，在病理情况下被诱导表达；其对微环境变化敏感，可即时改变其表达水平。TSP-1的表达水平受众多因素影响，如应激条件(热休克或缺氧)使其上调；TSP-1 在mRNA和蛋白水平受多肽生长因子上调，同时受p53肿瘤抑制基因产物表达水平的调节；TSP-1在蛋白水平被白介素-lβ 或肿瘤坏死因子α下调[9]。

2 血小板反应蛋白1与动脉粥样硬化性缺血性卒中

2.1 血小板反应蛋白1与血管反应 易损斑块的特征是薄纤维帽和大脂质坏死核心以及新生血管形成；而易损斑块倾向于破裂，随后发生出血、血栓形成等事件与新生血管的形成密切相关。脑血管局部形成动脉粥样硬化斑块或者其他部位的易损斑块脱落的栓子堵塞脑血管都是缺血性卒中的重要原因。在病理状态下，血管内皮细胞功能障碍，对血液成分的黏附能力改变，血管管径改变，对组织器官产生不利影响。大动脉和微血管研究均证实TSP-1表达水平增高在血管病理中的负面作用[8]。

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是经典的促血管生成因子，在新生血管生成中起关键作用；VEGF /eNOS/NO/sGC/cGMP信号转导途径控制血小板和炎性细胞的聚集和粘附、血管舒张及收缩功能，此通路受阻与缺血性卒中、局部缺血再灌注损伤等疾病密不可分[10]。VEGF可刺激eNOS(内皮源性一氧化氮合酶)的磷酸化，而TSP-1可以直接结合VEGF，从而抑制血管生成；TSP-1还可以与CD47结合抑制VEGF诱导血管内皮生长因子2酪氨酸激酶活化的能力，从而抑制Src(酪氨酸激酶)和Akt(苏氨酸激酶)的活化，降低eNOS活性使NO信号传导受阻[11，12]。TSP-1与 CD47结合抑制了基础的和NO刺激的sGC(可溶性鸟苷酸环化酶)活化；在内皮细胞中，TSP-1通过抑制VEGF减少cGMP(环鸟苷一磷酸)的生成，同时TSP-1与CD47结合抑制cGMP依赖性蛋白激酶(cGK)的下游信号传导。TSP-1抑制信号通路VEGF /eNOS/NO/sGC/cGMP的各个环节，使局灶性缺血后脑血流量减少、血小板和炎性细胞黏附增加，促进组织损伤[10，12，13]。

虽然TSP-1可以抑制新生血管生成，但TSP-1以及其与CD47结合对VEGF /eNOS/NO/sGC/cGMP信号通路的抑制作用远大于其益处；在严重的组织缺血模型中，与仅使用一氧化氮前体药物治疗相比，用CD47拮抗剂抗体与一氧化氮前体药物共同治疗，使组织存活率提高了100%[10]。

2.2 血小板反应蛋白1与氧化应激 大量的实验证据表明氧化应激与线粒体功能障碍有关，缺血性卒中损伤的标志之一是线粒体功能障碍[14]，线粒体产生ROS、调节NLRP3(模式识别受体家族中Nod样受体域蛋白)炎症激活促进缺血性卒中的进展，线粒体动力学(如裂变，融合和转移)在缺血性卒中后的发展中具有关键作用；同时，ROS可导致线粒体呼吸受损和线粒体自噬增加，最终导致线粒体功能障碍，影响炎症反应和凋亡过程。ROS引发涉及许多细胞因子和信号通路的复杂病理过程，减少ROS产生对于缺血后细胞存活和神经系统改善至关重要[15，16]。

当TSP-1与细胞表面受体CD47 结合时，会导致线粒体二价钙离子水平升高和线粒体膜电位水平降低，引起线粒体功能障碍；此外，两者结合激活PKC(蛋白激酶C)以及Nox亚基P47phox的磷酸化以Nox-1(氮氧化物)依赖方式刺激血管平滑肌产生超氧阴离子[17，18]。人脑内皮细胞是血脑屏障的主要组成部分，不仅在细胞基质信号传导中起重要作用，而且还分泌神经元营养因子，在缺血性卒中中，血脑屏障和内皮稳态很重要。体外建立的脑内皮细胞氧化应激模型，TSP-1响应氧化应激而积极产生，CD47通过与TSP-1结合，上调细胞间黏附分子1和血管细胞黏附分子1，促进周围白细胞的粘附和迁移，激活凝血功能系统和血脑屏障破坏[19，20]。抑制TSP-1和CD 47的结合，可减轻氧化应激，改善中枢神经系统功能。

有文献报道，TSP-1在胰岛B细胞中可通过激活核因子红系2相关因子2(Nrf2)信号可起到氧化应激防御作用[21]。Nrf2是一种基本的亮氨酸拉链蛋白，在氧化应激下，Nrf2易位至核，调节内源性抗氧化剂蛋白质，从而防止氧化损伤。缺血性卒中小鼠模型中，激活Nrf2可启动内源性抗氧化剂程序，小鼠的神经功能缺损得到改善，梗死面积减少以及与脑水肿相关的缺血后损伤减轻[22～24]，但是 TSP-1是否在脑组织中激活Nrf2发挥氧化应激防御作用值得进一步研究。

2.3 血小板反应蛋白1与炎症反应 许多研究发现，小胶质细胞和单核细胞/巨噬细胞会发挥吞噬清除功能，但也会增加斑块不稳定性，参与血栓形成。循环单核细胞通过内皮细胞迁移到脑实质中，小胶质细胞是中枢神经系统中的常驻免疫细胞，在组织损伤期转化为活化的巨噬细胞；小胶质细胞与循环中单核细胞衍生的巨噬细胞相似，激活后分化为经典的促炎表型和替代的抗炎表型，除了吞噬因脑损伤引起的细胞碎片外，还产生多种神经营养因子和免疫调节因子参与调节大脑的重塑和修复。在卒中的不同阶段观察到小胶质细胞的双重作用，小胶质细胞和巨噬细胞吞噬清除死亡神经元，促进脑部炎症的消退；受微环境中细胞因子的调节，随着病变进展，小胶质细胞和巨噬细胞由最初的抗炎表型逐渐转化促炎表型[1，25～27]。在缺血性卒中的慢性期，活化的小胶质细胞广泛分布是卒中后全脑炎症的一个突出特征。星形胶质细胞是大脑中最丰富的神经胶质细胞，在正常的生理条件下为神经元提供营养支持，并调节突触活动；在缺血性卒中发生后，星形胶质细胞也被激活，活化的星形胶质细胞释放多种促炎因子，促进炎症反应，加重脑组织损伤[26]。

NF-κB(核转录因子)是经典的炎症反应转录因子，是缺血性卒中炎症反应的主要参与者，其可通过低氧、ROS和几种炎症介质来激活；同时，它可以调节多种促炎因子产生，包括白介素6、白介素1β和肿瘤坏死因子α。动物实验已经证实，NF-κB途径的选择性抑制，可以减轻大鼠的脑缺血再灌注损伤，下调脑组织炎性细胞因子，减少缺血引起的神经元凋亡，减轻血脑屏障破坏，改善神经功能并减轻其脑水肿和梗死面积；NF-κB的选择性抑制还可以抑制星形胶质细胞活化，随后下调星形胶质细胞释放的趋化因子减少脑组织继发性炎症损伤。此外，抑制TLR4 /NF-κB途径的激活可以降低NLRP3炎性体成分的表达，阻断促炎型小胶质细胞的极化。在对巨噬细胞的研究中，TSP-1通过NF-κB信号通路促进炎症性细胞因子的表达，也通过激活TLR4(Toll样受体4) /NF-κB途径刺激巨噬细胞产生肿瘤坏死因子α。抑制 TSP-1可能会抑制免疫细胞的活化和促炎因子的产生[28～31]。

JAK2(Janus激酶2) / STAT3(信号传导及转录活化因子3)信号通路是缺血性卒中后被激活的另一引发炎症反应的途径，抑制JAK 2/ STAT3通路可以降低基质金属蛋白酶的表达，减少神经炎症和细胞凋亡，并改善急性缺血性卒中的血脑屏障完整性[32，33]。TSP-1对JAK2/ STAT3通路作用的研究仅限制于结肠炎，TSP-1衍生肽能够抑制结肠组织中STAT3的活化，有效控制结肠炎症和血管生成[34，35]。TSP-1是否对在脑组织中激活的JAK2 / STAT3途径具有抑制作用还有待进一步研究。

炎症和血栓形成是相互影响的两个过程，急性缺血性卒中患者的血小板以高度活化的状态存在，活化的血小板与单核细胞相互作用触发炎症反应，活化的单核细胞能够通过独立于经典的血小板粘附机制捕获不受刺激的血小板，通过产生组织因子促进凝血酶生成，激活血小板[36]。TSP-1作为血小板与活化单核细胞的黏着性连接分子，可促进局部血栓形成。因此，减少TSP-1 表达，抑制单核细胞和血小板的活化，不仅可以减少血小板分泌TSP-1，还可以抑制血栓形成。

2.4 血小板反应蛋白1与星形胶质细胞 在缺血性卒中发生后，缺血性损伤会导致广泛的树突棘丢失，棘突的丢失可能会导致功能改变，树突棘是否恢复取决于局部缺血的严重程度[37]，早日解除局部缺血和促进新的突触形成是卒中治疗的目标，树突棘的恢复可改善卒中后的神经系统功能。

TSP-1对eNOS/NO/sGC/cGMP信号途径的抑制作用会限制卒中后的组织再灌注[38]；而在缺血性损伤的恢复阶段，神经元释放尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)，星形胶质细胞将uPA受体募集到其质膜，uPA与星形细胞uPAR(uPA受体)的结合激活ERK1 / 2(细胞外信号调节激酶1/2)介导的STAT3途径，STAT3直接与TSP-1启动子结合从而使TSP-1蛋白水平的升高，参与突触可塑功能[39，40]。星形胶质细胞不仅参与了炎症反应，对突触的修复更是起到了关键作用；而星形胶质细胞产生的TSP-1一方面参与局部组织缺血过程，一方面有助于突触修复。无论对缺血性卒中的发展有利还是有害，TSP-1都参与其中，因此需要进一步研究TSP-1在缺血性损伤中的突触形成潜力是否超过其负面调节作用。

3 TSP-1作为缺血性卒中治疗靶点的潜力

TSP-1作为细胞基质蛋白，能够与细胞表面多种受体结合，参与多种信号通路发挥作用；其参与动脉粥样硬化性缺血性卒中病理过程，可能是治疗的新的研究方向。TSP-1缺乏可减少与肥胖相关的炎症以及巨噬细胞的迁移、黏附和炎症信号；巨噬细胞源性的TSP-1与CD47相互作用可刺激主动脉瘤中巨噬细胞募集和炎症发生，调节单核细胞的迁移和黏附，促进主动脉瘤的发展[41]；当敲除CD47时，可观察到脊髓损伤后炎症减少[37]；与此相一致，在肝移植缺血再灌注的研究中，阻断TSP-1/CD47 使其对NO/cGMP信号传导的抑制作用消失，并且减少了再灌注组织中中性粒细胞和巨噬细胞的浸润，促炎细胞因子的分泌以及ROS的产生[42]，缺血性卒中同样存在缺血再灌注过程，并且在预后较差的患者血清中TSP-1浓度较高，因此阻断TSP-1与CD47的结合可能对缺血性卒中同样有益。

4 展 望

缺血性卒中发生的两大主要原因是(1)在局部的动脉粥样硬化病变促进血小板黏附、聚集和释放，最终形成血栓；(2)大动脉的粥样硬化斑块碎片或者破裂、出血，形成的栓子脱落堵塞脑小血管。动脉粥样硬化病变的病理过程以及缺血性卒中进展过程，都包括氧化应激、炎症反应和血管反应。现临床上使用的调脂、抗血小板和营养神经等药物在单个方面治疗缺血性卒中；而TSP-1对血管生成及血管舒张、免疫细胞激活、活性氧的产生以及突触的修复都有影响，开发TSP-1拮抗剂或者其受体CD47的拮抗剂用于治疗缺血性卒中可能使患者受益更多。