三维培养的间充质干细胞球体的生物学特性及应用的研究进展

唐敏英 雷艳 詹世淮 李荣春 路君 吴仲秋

间充质干细胞 （mesenchymal stem cells，MSCs）具有自我修复和分化成多种组织 （如成脂、成骨和成软骨）的能力，其分化的潜能使基于MSCs 的细胞治疗广泛应用于多种疾病[1]。MSCs 的培养常使用传统的细胞单层培养，也称之为二维 （two dimensional，2D）培养，虽然2D 培养对细胞扩增方便且高效，但它高度人工化，忽略了细胞与细胞，细胞与细胞基质之间相互作用激活的细胞信号网络的重要性[2]。这就需要提出MSCs 体外培养的新方法，即三维 （three dimensional，3D）细胞培养技术。

3D 细胞培养是指利用多孔支架、胶原凝胶等为细胞提供一个更加接近体内生存条件的微环境，细胞以3D 空间的方式与细胞外基质 （extracellular matrix，ECM）、各种细胞因子、化学因子及其他细胞发生交流和相互作用[3-5]。MSCs 3D 培养的方法有多种，主要包括微球体黏附培养、生物聚合物支架培养、水凝胶三维培养及动态灌注和微流体驱动的生物反应器等。3D 动态培养过程中，氧气和营养流动增加，细胞废物清除加快及流体剪切力的产生构成了细胞微环境，3D 细胞培养与2D 单层细胞培养在细胞表型、生物学应答方面有明显的不同[6]。MSCs 微球体黏附培养被认为是提高MSCs 细胞疗法的优化方式之一。此方式增加了细胞与细胞之间的接触以及细胞与细胞外基质的相互作用，使得细胞以适应于自身形态的方式生长而影响他们的信号活性[7]。本文就微球体黏附培养的MSCs 生物学特性及其功能应用进展进行综合阐述。

一、3D 微球体培养MSCs 的生物学特性

（一）3D 微球体培养MSCs 的表型和大小

水凝胶3D 培养的MSCs 相较于普通培养：CD73、CD90 和CD105 高表达，而CD271 和CD146 的表达降低，HLA- ABC 及CD166 的表达水平无显著改变[8]。3D 培养MSCs 内层细胞形成一个核心无坏死的多细胞球体，细胞形态为圆形，随后细胞在球体表面逐渐排列，7 d 后在球体表面形成扁平层，外层细胞为长梭形[9]。流式细胞术前向散射特性分析表明，3D 培养MSCs 的体积比2D 单层培养的细胞体积明显减小，个别细胞的体积减少75 %，且细胞大小更均一[10]。Mo 等[11]研究对球体培养的MSCs 细胞体积更小作出了解释，球体MSCs 中b1 整合素 （CD29）的表达以及一些α 整合素结合链的表达，导致肌动蛋白解聚，细胞骨架张力降低，MSCs 分泌的小囊泡更容易向胞外分泌，从而使得细胞形态排列更紧密、体积更小，能更好的进入体内微循环发挥作用。

（二）3D 微球体培养MSCs 的分化潜能

3D 培养MSCs 细胞表面某些抗原表达变化是否会影响MSCs 的分化潜能。球体培养的人骨髓间充质干细胞（human bone marrow-derived mesenchymal stem cells，hBMMSCs）在成骨分化过程中其成骨分化的核心结合因子1（core binding factor1，CBFA-1）、碱性磷酸酶、骨粘连蛋白、胶原蛋白Ⅰ和骨桥蛋白的表达均增加[12-13]。Chatterjea 等[14]研究发现磷酸钙陶瓷颗粒与富含血小板血浆制备的凝胶体系内hBM-MSCs 无论是第7 天、14 天还是21 天，成骨能力都比2D 单层培养强。软骨分化的基因，如基质金属肽酶13 （matrix metalloproteinase 13，MMP13）、骨唾液蛋白SPP1（secreted phosphoprotein 1，SPP1）、基质gla 蛋白 （matrix carboxyglutamic acid protein，MGP）上调最明显，相反钙调蛋白1明显下调，连续培养21 d 的hBM-MSCs 球体钙磷酸盐的矿化明显更低，而矿化的软组织柔顺性降低，僵硬度增加，功能减退[8]，这表明3D 细胞培养更有助于人类成骨细胞的分化。

在成脂方面，3D 培养的MSCs 成脂标志基因C/EBPa,LPL和aP2 均比2D 单层培养的表达增加[15]。Saleh 等[16]发现Dkk-1 的累积能抑制内源性Wnt 信号通路的激活，诱导MSCs 球体成脂分化能力增加，Wnt 可能是3D 球体培养的MSCs 激活成脂的分子开关。综上表明在3D 培养条件下MSCs 的成骨与成脂分化能力均增加。

（三）3D 微球体培养MSCs 基因表达谱的改变

微阵列比较分析发现与缺氧、血管生成、炎症、免疫应答和细胞凋亡相关的基因在不同的培养条件下表达差异明显。血管生成素2 （angiogenin-2，ANG2）、趋化因子受体4 （CXC motif chemokine receptor type 4，CXCR4）、和血管内皮生长因子-A （vascular endothelial growth factor-A，VEGFA）的表达显著上调[17]。Carter 等[18]制备了聚己内酯与明胶复合的电纺纤维支架提供3D 微环境，发现3D 培养的MSCs 肝细胞生长因子 （hepatocyte growth factor，HGF）和细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）等浓度比2D 培养高5 倍以上。Bartosh 等[19]将MSCs 分别进行2D 与3D球体培养，基因表达分析结果表明，所有3D 球体MSCs 抗炎/免疫调节因子，如环氧化酶-2 （prostaglandin endoperoxide synthase 2，PTGS2）、肿瘤坏死因子α 诱导蛋 白6 （tumor necrosis factor alpha inducible protein 6，TNFAIP6）和锡钙质1 （stannic calcium 1，STC-1）均高表达，传代后期的MSCs 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 （tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand TRAIL，TNSF10）的高表达逐渐变小，但与2D 培养相比，P7 球体中TNSF10的高表达仍然上调，这表明3D 培养的技术可以避免大量扩增后造成MSCs 细胞特性改变这一问题。

虽然3D 培养的MSCs 基因表达改变的分子机制尚未明确，但这些基因表达谱的差异使得3D 培养的MSCs 细胞可能在血管生成、组织修复、抗炎反应及维持干性方面更具重要的意义。

二、3D 微球体培养MSCs 的生物学功能

组织修复和再生是人体必须的生物学功能，正常的组织修复过程包括炎症细胞的募集、新生血管的形成以及活性修复3 个阶段。提高MSCs 的细胞疗效的方法很多，MSCs 球体的制备是其中一个优化方法，3D 培养条件已被证明能提高MSCs 干性并延缓衰老，增强抗炎作用，增强血管生成并促进组织的再生和修复。

（一）增强体内微循环

Tietze 等[20]研究表明，3D 球体培养的MSCs 尺寸更小、变形能力增强，尾静脉注射后被截留在肺部的细胞数量明显降低，在肝脏、心脏和肾脏等器官微循环中发现了大量MSCs衍生的DNA，且表现出差异性分布。3D培养的MSCs在肝脏、心脏和肾脏等器官中更均匀的分布，微循环网络更加广泛。因此，使用创新的细胞培养技术调节形态结构，MSCs 的流变学表型将提高临床干细胞治疗的可行性。

（二）增强干性并延缓衰老

MSCs 的干性使得其在组织工程及临床应用上具有巨大的潜力。然而，在传统的体外单层培养条件下，干细胞的干性逐渐丧失，影响到临床应用的效果。研究表明3D 球体培养MSCs 的多能性标记基因Nanog和Oct4，Sox2，POU5F1表达增加[2]，体外培养的MSCs 的衰老延迟。Li 等[21]研究也表明，Oct4，Sox2，Tra-1-60和SSEA-4在2D 与3D 体系中都大量表达，但促进干细胞自我更新的基因Klf-4 在这2 中培养体系中却差异性表达，其在3D 球体培养MSCs 中的表达水平高于2D 培养MSCs 的4 倍；克隆形成效率高于2D培养MSCs 的2 倍。Tietze 等[20]研究表明，3D 球体培养的MSCs 高表达HSPC 支持因子，更容易扩增为含有CD45+/CD34+/CD133+的造血干细胞来维持干性。综上所述，多向分化潜能的增强，细胞衰老过程的延迟，多能性标记基因的上调意味着MSCs 球体干性增强。

（三）增强抗炎反应

在炎症状态下，一方面MSCs 可以调节炎症因子的分泌修复机体由于炎症引起的损伤。研究表明3D 培养的MSCs抗炎反应增强，3D 球体经LPS 刺激或经LPS 与IFN-γ 联合刺激会导致TNF-α 表达降低，随后上调IL-10 的分泌及CD206 的表达，IL-10 与CD206 是巨噬细胞抗炎的标志分子[22]。此外，Su 等[17]研究表明3D 纤维电纺支架中的MSCs分泌的抗炎和促进伤口愈合的因子COX2、PGE2、iNOS、TSG6 等的表达增加，且与血管生成相关的因子VEGF、HGF和bFGF 的表达量也明显上调。

另一方面，MSCs 球体通过影响效应细胞 （如巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞和T 细胞）来抑制炎症反应和调节体内免疫[23]。3D 培养的MSCs 除了分泌炎症相关的活性生物分子外，也能通过调控免疫细胞，如巨噬细胞的极化来抗炎，Bartosh 等[19]研究表明3D 球体培养的MSCs 负责巨噬细胞极化的PGE2 表达明显上调，PGE2 抑制巨噬细胞活化，晚期传代培养的MSCs 球体仍分泌大量的PEG2，对巨噬细胞的激活仍有较强的抑制作用。

除了在抗炎方面发挥作用外，也有研究表明3D 培养的MSCs 调控促炎因子的分泌，如上调促炎细胞因子IL1A，IL1B，IL8 和趋化因子配体2 （cc motif chemokine ligand 2，CCL2）、趋化因子配体7 （cc motif chemokine ligand 7，CCL7）招募炎症细胞发挥促炎作用[24]。对此给出的解释是，MSCs需要刺激促炎细胞因子获得抗炎特性，同时又通过自分泌IL1 而增强抗炎作用。简言之MSCs 球体通过分泌炎性因子作为开启抗炎作用的开关，这也被证明是MSCs 介导抗炎作用所必需的。

（四）增强血管生成和组织修复再生

首先，如前所述3D 球体培养的MSCs 高表达与血管生成相关的细胞因子，包括血管生成素 （angiopoietin，Ang）、ANGPT2、成纤维细胞生长因子2 （fibroblast growth factor 2，FGF2）、HGF 和血管内皮生长因子 （vascular endothelial growth factor，VEGFA）。在VEGFA 存在的条件下，ANGPT2激活内皮细胞并产生很强的血管生成反应[17,25]。Xu 等[26]报道脂肪来源的间充质干细胞 （adipose derived mesenchymal stem cells，AD-MSCs）球体高水平分泌分泌HGF、VEGF，注射到缺血再灌注大鼠模型能明显减少组织损伤，促进血管生成并改善肾功能。

其次，3D 培养的MSCs 调控组织修复相关的细胞因子分泌。Rettinger 等[27]研究证实，AD-MSCs 球体旁分泌的与伤疤形成和纤维化相关的结缔组织生长因子 （connective tissue growth factor，CTGF）表达明显下调，而加速伤口愈合的细胞转化生长因子β3 （transforming growth factor beta-3，TGFβ3）表达显著上调。

再次，除了损伤修复相关的基因外，干细胞的迁移特性也与组织修复息息相关。3D 培养的AD-MSCs 球体的条件培养基能更好的促进人角质细胞HaCaT 迁移，使得划痕伤口变小[27]。Li 等[21]将人脐带间充质干细胞 （human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs）球体移植入四氯化碳肝损伤小鼠模型24、48 h 后，与移植入2D 培养的hUC- MSCs 相比，球体MSCs 能更有效地迁移到损伤的肝脏，经各项肝功能测定分析hUC-MSCs 球体促进肝损伤小鼠肝脏再生和修复，肝脏坏死水平下降。

总之，3D 球体MSCs 通过直接分泌血管生成、组织修复相关的各种活性因子及促进MSCs 球体的迁移能增强血管生成并促进组织修复。

（五）应用于骨组织工程

3D MSCs 球体促进骨细胞分化的机制主要包括，第一，通过上调E-cadherin 表达激活ERK/AKT 信号通路，促进VEGF、PDGF 的分泌；第二，球体培养的MSCs 抗凋亡和抗炎的基因表达上调；第三，通过Wnt3a/5a 信号通路促进成骨细胞基因成骨细胞基因相关转录因子2 （runtrelated transcription factor 2，RUNX2）、碱性磷酸酶 （alkaline phosphatase，ALP）等转录[28]。Lam 等[29]发现50%融合密度的MSCs 球体比100%融合密度的单层培养的MSCs 现出更好的体外成骨能力，更高水平的钙沉积。将50%融合的3D MSCs 植入颅骨缺损大鼠模型中，骨愈合效果更加显著。Sobacchi 等[30]研究发现将MSCs 与功能化的聚L-乳酸纳米纤维组成的3D 支架体系应用于大鼠颅骨损伤模型中，植入后骨钙素、BMP2 及SMAD5 表达上调，提示成骨细胞体系被激活，但也存在一定的限制，即骨的形成有限，主要是边缘区域骨形成明显不足。

此外，共培养也已经成为骨组织工程中促进血管化的重要策略。Chen 等[31]以兔外周血间充质干细胞 （peripheral blood-derived mesenchymal stem cells，PB-MSCs）和 内 皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）S 共培养于双相磷酸钙生物陶瓷支架培养系统，发现与新生骨形成和血管形成起重要作用的VEGF、血小板衍生生长因子 （platelet derived growth factor，PDGF）和ALP 的表达逐天增加，在2 周内PDGF 的表达量从 （84.56±13.05）pg/mL 迅速上升为（1315.69±35.12）pg/mL，且体内实验证实，将细胞种植支架植入长骨缺损模型中血管生成和成骨能力增加，3 个月内大量新骨形成，可以成功地恢复长骨缺损。

（六）其他应用进展

Kim 等[32]通过比较2Ds 和3D 球体培养的胎盘源性间充质干细胞 （placenta-derived mesenchymal stem cells，PD- MSCs）对去卵巢大鼠的治疗效果，研究发现球体组PD- MSCs 卵巢特异性转录因子nano3、Nobox 和Lhx8 的表达水平高于对照组，球体PD-MSC 移植可以通过增加雌激素的产生和促进卵泡发生而恢复Ovx 大鼠卵巢功能，进一步表明球形培养的PD-MSCs 通过提高移植效率来增强治疗潜力，首次报道可以在微平台上成功制备并将球体PD-MSC植入卵巢障碍的大鼠中，这一发现提高了大家对生殖系统干细胞疗法的理解，并可能为临床上卵巢功能障碍的研究提供新的治疗思路。

最新有球体MSCs 应用于角膜损伤的研究，Carter等[18]通过制备聚已内酯与明胶复合物的电纺纤维支架为BM- MSCs 提供3D 微环境，结果显示3D 培养的BM-MSCs所分泌的HGF 和ICAM-1 5 倍高于2D 培养，MSCs 电纺纤维系统植入角膜后，角膜中α-SMA 的表达降低，抑制了成纤维细胞的转化，促进角膜成纤维细胞和外植角膜上的伤口愈合，减少瘢痕形成，为球体MSCs 的应用与眼角膜损伤提供了新的视点。

三、问题与展望

长时间使用标准2D 培养的MSCs 失去了很多特性，动态3D 细胞培养本质上是体外建立的类似于体内微环境的微观体系，提供了一个细胞与细胞之间，细胞与胞外基质之间的直接接触和相互作用的微环境，能更好的保持MSCs 的表型和多项分化的潜能[3,5]。

3D 培养的MSCs 成脂、成骨分化和成软骨的能力增强。MSCs 球体的制备被认为是提高MSCs 细胞疗法的优化方式之一，球体的形成能增强抗炎作用、增强血管生成、增加组织再生和修复作用并提高MSCs 移植后的存活率[17,23,25]。

但它也存在一定的局限性。首先，细胞的体外增殖、分化和代谢等生理活动都受到细胞微环境的影响，在3D 球体内部营养物质运输和氧气的扩散以及废物的代谢都受到球体尺寸大小的限制，这些 “压力”的存在有助于MSCs 球体的特征基因表达，但也会降低核心细胞存活率[5,7]。

其次，3D 培养的s 支架材料种类繁多，常见的支架材料包括天然材料，细胞外基质ECM，以及具有良好的生物降解性和融合性的合成材料，如聚乳酸，聚乙酸内酯等。由于单一材料存在一定的局限性，现将几种不同的材料通过物理或化学方法合成的新型复合材料能优势相结合，促进干细胞在最接近生物体内环境的3D 体系中增殖分化[33]。在不同的3D 体系中MSCs 表现出不同的生物学特性，Yu 等[34]比较了MSCs 在两种不同的3D 生物支架海藻酸/透明质酸（3D-Alg/HA）和海藻酸/羟磷灰石 （3D-Alg/Hap）中的生物学特性，发现在3D-Alg/Hap 中其细胞活性、细胞相容性及分化的特性都更好，这就表明选择合适的生物材料对MSCs 的培养尤为关键。

在组织工程修复过程中，MSCs 与3D 支架的生物材料所构成的培养体系一起移植入体内时，也要充分考虑生物材料的免疫原性及组织相容性，生物材料的可降解性，在保证发挥功能的前提下，对生物材料本身的安全性提出了要求。

最后，所构建的3D 培养体系与体内环境依然存在着明显的差异，细胞与ECM 之间的相互作用机制还不明确。3D培养的MSCs 分子的标准化这一定义还需要严格的规范。尽管3D 培养存在这些挑战，但不可忽视的是3D 培养的MSCs更进一步提高了其在再生领域中的应用前景。