间充质干细胞外泌体的研究进展

冉凤英 陈龙 罗丹 陈琴华,2

间充质干细胞 （mesenchymal stem cells，MSCs）主要的生物学特性包括高度的自我更新、多向分化及独特的免疫调节能力，其免疫调节能力则主要是通过MSCs 与先天免疫和适应性免疫系统的细胞相互作用，分泌细胞调节性因子发挥免疫调节功能[1-3]。研究表明，来源于间充质干细胞外泌体（exosomes from mesenchymal stem cells，MSCs-Exo）在组织的修复、免疫调节及疾病的治疗过程中发挥着至关重要的作用，可能为临床疾病诊断和治疗提供新的策略[4-5]。因此，了解MSCs-Exo 的生物学特性、免疫调节能力和临床研究现状将为MSCs-Exo 在组织损伤修复及其他临床疾病的研究提供理论依据。

一、MSCs-Exo 的生物学特性

1.基本的特征：1980年发现的外泌体（exosome）大多为微小囊泡，直径约为30 ～200 nm，在蔗糖溶液中的密度为1.10 ～ 1.18 g/mL，可由各种细胞分泌[6-7]。MSCs-Exo 不仅表达所有外泌体共同表达的蛋白标志物，还表达MSCs细胞膜表面的一些黏性分子 （如：CD90、CD105、CD29、CD44、CD73）[8]。同时，也存在一些其他种类的蛋白如Alix、TSG101、肌动蛋白、微管蛋白、膜联蛋白 （Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ和 Ⅵ）及一些信号转导蛋白和组织相融性抗原。另外，MSCs- Exo 富含胆固醇和鞘磷脂，具有脂质双分子层结构，从MSCs-Exo 中分离得到的脂肪酸主要有花生四烯酸、二十二碳六烯酸、白三烯、磷脂酸和前列腺素溶血磷脂酰胆碱[9]。外泌体中的脂质成分可因其来源不同而表现出一定的差异，这些脂类的主要作用是维持外泌体的形态和作为信号分子参与生物信息传递。除此之外，MSCs-Exo内还含有大量的RNA （microRNA和mRNA），少量线粒体DNA （mtDNA）、长链非编码 RNA（lncRNA）、核糖体 RNA （rRNA）、piRNA、tRNA、snoRNA 和snRNA[10]。

2.提取、保存和鉴定：现有的外泌体提取及分离技术主要包括超速离心技术、超滤技术、聚乙二醇沉淀、免疫磁珠捕获技术以及微尺度和纳米尺度的微流控芯片技术[11-15]，而这些技术在提取外泌体时都各有优缺点，选择提取方法时应根据分离原理、样本量及后续实验要求合理选择[16-19]。成功分离的外泌体若不进行后续研究，如何合理保存是科研过程中需要考虑的一个重要问题。研究发现，保存环境对外泌体的直径及完整性有较大的影响，将提取好的外泌体放于室温条件下2 d，发现其直径下降60%；4 ℃放至4 ～5 d 直径下降25%；-20 ℃较短时间保存直径未发生明显变化；而-80 ℃保存在较长时间内外泌体保持稳定，同时，如果反复冻融外泌体样本，也会导致其RNA 含量降低[20-21]。总之，提取成功的外泌体要尽快进行实验，且每次用于实验研究的外泌体保存条件应保持一致，避免人为因素导致每次的实验结果不一致。

外泌体的鉴定是后续实验的基础，只有保证外泌体的纯度和活性才能确保后续实验的可信度。外泌体的鉴定通常需要通过形态、粒径分布和蛋白标志物等综合考量，而目前用于鉴定外泌体的技术主要包括扫描电镜 （scanning electron microscope，SEM）、原子力显微术 （atomic force microscopy，AFM）、动态光散射 （dynamic light scattering，DLS）、纳米粒子跟踪分析 （nanoparticle tracking analysis，NTA）、透射电镜术 （transmission electron microscopy，TEM）、流 式 细胞检测分析 （flow cytometry analysis，FCAs）、免疫印迹技术 （Western blot，WB）和酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）等[22]。鉴定外泌体时通常联合使用以上2 或3 种方法，而在大多数研究中，NTA、TEM和WB 技术常常被认为是鉴定外泌体的首选方法[23]。

二、MSCs-Exo 免疫调节作用

研究表明，MSCs 可以通过细胞-细胞直接接触或旁分泌方式调解T 细胞的功能，而且MSCs 在抑制细胞因子的分泌和抑制配体-受体相互作用的功能中发挥了关键作用。基于这一假设，MSCs- Exo 被认为可以通过这一机制诱导外周耐受性T 细胞的耐受性分子。Mokarizadeh 等[24]研究表明MSCs 分泌的微泡能够抑制自身反应性淋巴细胞的增殖，促进抗炎细胞因子的分泌包括白细胞介素10（interleukin-10，IL-10）、转化生长因子（transforming growth factor-β，TGF-β）等。近年来，随着对外泌体研究的深入，发现外泌体可以有效激活或抑制免疫反应[25]。外泌体在免疫细胞信息通讯中的一个重要作用是参与抗原呈递。Zhang 等[26]研究表明，MSCs- Exo 通过激活M2 型巨噬细胞，抑制M1 型巨噬细胞，以及增强抗炎细胞因子IL-10 和TGF- β 的表达来调节免疫细胞反应，以促进组织修复。Chen 等[27]研究发现MSCs-Exo能够抑制IL-1β 和TNF- α 的分泌，促进TGF-β 分泌，进一步研究表明MSCs-Exo 能够诱导Th1 向Th2 细胞转化，外泌体以MSCs 类似的方式通过减少炎症和促进抗炎反应来抑制促炎症反应的发生。

另有研究发现外泌体不仅能在免疫细胞分子间呈递抗原和信息分子，还能通过RNA 的方式在细胞间传递遗传信息。外泌体可以将miRNAs 传递给受体细胞，然后调节靶基因的表达，如：在低氧培养条件下，发现骨髓MSCs 分泌的外泌体中含有伤口愈合相关的miRNA，如miR-223、miR-146b、miR- 126 和miR-199a，而这些外泌体可以调整肌肉损伤模型中M1/M2 平衡[28-29]。另外，一些MSCs-Exo 的miRNAs 在许多组织中调节不同的炎症反应方面起着至关重要的作用，也影响免疫细胞的表型[30-31]，如：miR-34a、miR-122、miR-124 和miR-127 能够使机体抗炎和抗增殖水平增加；而miR-21 和miR- 181 失调诱导慢性炎症，并且这种miRNA 在控制初始促炎和迟发免疫调节之间的平衡起着关键性的作用[32]。此外，如果将含有miRNA-146a 的MSCs- Exo 转移到巨噬细胞中，其可以通过向M2 型巨噬细胞极化增加机体的抗炎反应，使脓毒症小鼠的存活率提高[31]。

三、MSCs-Exo 在临床疾病治疗中的研究

1.MSCs-Exo 在伤口愈合和皮肤再生中的应用：MSCs参与皮肤伤口愈合的整个过程，而外泌体是MSCs 释放的关键因子之一，具有MSCs 相似的功能，可以调节受体细胞的活性，促进细胞自我修复和组织再生，加速损伤部位的伤口修复[33]。研究表明，MSCs-Exo 可以促进受体巨噬细胞向抗炎M2 型转变，此外，还能调节B 淋巴细胞的活化、分化和增殖，并能抑制T 淋巴细胞的增殖。MSCs-Exo 还可将活化的T 淋巴细胞转化为调节性T 细胞，从而发挥免疫促进作用[34-35]。另外，在许多疾病模型中，MSCs- Exo 可以促进抗炎细胞因子的上调（如：IL-10），而据报道，IL-10 在调节皮肤伤口炎症和瘢痕形成中起着至关重要的作用[36]。Geiger 等[37]发现MSCs-Exo 可通过诱导糖尿病大鼠模型中皮肤细胞的迁移和增殖来加速伤口愈合。各种研究表明，MSCs-Exo 还可通过特定的miRNAs 发挥免疫调节作用，Li 等[38]发现携带miRNA-181c 的脐带MSCs- Exo 通过下调Toll 样受体4（toll-like receptor 4，TLR4）信号通路，减轻烧伤引起的强烈炎症反应。综上研究表明，MSCs-Exo 在伤口愈合的整个阶段发挥了重要的调节作用。基于此机制MSCs-Exo 将有望用于临床免疫系统类疾病的治疗。

2.MSCs-Exo 在肿瘤微环境中的应用：MSCs- Exo 在肿瘤的发生、血管生成和转移中的作用，研究者们持有不同的观点。Qi 等[39]研究发现，骨髓中MSCs-Exo 能够通过激活骨肉瘤和胃癌细胞株中的Hedgehog 信号通路，促进肿瘤的生长；Vallabhaeni 等[40]指出，MSCs-Exo 通过传递miRNA-21和miR- 34a，促进乳腺癌细胞的增殖和转移；MSCs- Exo 将mRNAs 和miRNAs 转运到靶细胞并诱导内皮细胞增殖，从而促进血管生成和毛细血管网络的形成，而胎盘MSCs-Exo已被证明可促进胎盘微血管内皮细胞迁移和血管形成[41-42]。虽然MSCs-Exo 在很大程度上介导了肿瘤微环境中的肿瘤促进作用，但也有证据表明MSCs-Exo 具有抗肿瘤活性。Wu等[43]报道，来自人脐带的MSCs- Exo 可能通过下调磷酸化的AKT 蛋白激酶和上调caspase-3 来抑制膀胱癌细胞的发育；同样地，来源于MSCs-Exo 通过降低Bcl-xL 的活性和通过caspase-3/7 途径促进细胞凋亡，并通过传递miR- 145来抑制前列腺癌[44]；另外，从正常人骨髓MSCs 中获得的外泌体可抑制肝癌和卵巢肿瘤细胞株的增殖，导致癌细胞凋亡[45]。Roccaro 等[46]研究发现来自多发性骨髓瘤患者的骨髓MSCs-Exo 可以促进多发性骨髓瘤肿瘤细胞的发展，而从正常个体中分离的外泌体则表现出相反的作用，其可通过转移较低含量的miR-15a 来抑制多发性骨髓瘤肿瘤细胞的发展。综上研究表明，外泌体对肿瘤细胞的作用可能因其来源和肿瘤细胞类型不同而表现出抑制或促进作用。具体作用机制还需后续深入研究。

3.MSCs-Exo 在神经损伤中的应用：MSCs-Exo 可以将许多遗传物质、神经营养因子和蛋白质传递到轴突，恢复微环境的稳态，调节轴突再生、促进神经形成和血管生成[47]。Wei 等[48]发现来源于骨髓的MSCs-Exo 具有支持血管形成作用，可抑制外周血单核细胞分泌IFN-γ，内含有免疫相关microRNA（miR-301、miR-22、miR-let-7a 等），能促进人脐静脉血管内皮细胞的血管和网状结构形成；最近研究发现特 定 的miRNAs （miR-23a、miR-200、miR-133b、miR-17-92等）过表达可以促进神经基因和髓鞘化的形成，而在这过程中主要是外泌体将miRNAs 从神经元细胞体转移到轴突，从而介导轴突生长[49]；此外，有研究报道称牙龈来源的MSCs-Exo 能够诱导分化（修复）表型相关基因的上调，从而促进外周神经细胞的再生[50]；Huang 等[51]发现PEDF 修饰的脂肪MSCs-Exo 可以激活细胞自噬，抑制神经元细胞凋亡，从而改善脑损伤；另外，近年来研究发现MSCs- Exo 还可通过传递miR-30d-5p 来抑制小胶质细胞的自噬，最终促进小胶质细胞向抗炎表型的极化，从而逆转神经元的损伤，本研究不仅解释了MSCs-Exo 介导神经炎症促进神经发生的机制，而且还提示MSCs-Exo 可能是一种很有前途的基因传递载体，可以减轻神经炎症[52-53]。虽然目前许多实验证据表明，利用MSCs-Exo 治疗周围神经损伤是有效和安全的，但这一领域还有待进一步研究，需要大量的工作来充分确定MSCs-Exo在临床应用中的潜力。

4.MSCs-Exo 在肝损伤和肾损伤中的应用：在肝脏疾病相关实验研究中，MSCs-Exo 也表现出一定的保护和治疗作用。Du 等[54]研究证明人诱导的多能MSCs-Exo 通过激活SPhks 和s1p 信号通路保护肝脏免受肝缺血/再灌注损伤，促进细胞增殖。而这一发现将可能有助于促进肝脏再生方面的研究，并对急性肝病新治疗方法有重要的意义；Li 等[55]研究发现MSCs-Exo 在小鼠肝纤维化模型中有治疗作用，采用四氯化碳 （carbon tetrachloride，CCL4）诱导的小鼠肝损伤模型中发现人脐带MSCs-Exo 可以通过抑制肝细胞上皮间充质细胞的转移和胶原蛋白的生成来改善肝纤维化；Hu 等[56]也证明人脂肪MSCs-Exo 可以分泌各种细胞因子 （如：肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子等），促进肝细胞的再生和维持肝功能。目前，肾损伤相关实验研究也表明，外泌体中携带的miRNA 和蛋白能够减轻肾缺血再灌注损伤，减少细胞凋亡，促进细胞增殖，从而修复肾损伤[57]。Jia 等[58]发现MSCs-Exo 可以通过调节ATG16L 增强细胞自噬，预防顺铂药物所致的急性肾损伤；另有一研究组分析了人胚胎和骨髓来源MSCs-Exo 中的蛋白质，结果表明，外泌体中含有与血管生成（VEGF、促血管新生蛋白因子）、炎症（TNF-α）和TGF-β 信号相关的营养蛋白分子，可以促进肾组织再生[59]。以上研究结果表明，外泌体对于肝和肾损伤的疗效是肯定的，外泌体中携带的miRNA 和蛋白是治疗肝损伤和肾损伤的关键性物质，因此，在今后的研究中还需深入研究其治疗作用机制，以便早日用于临床治疗。

5.MSCs-Exo 在其他疾病治疗中的应用：研究表明，MSCs-Exo 在其他疾病的诊断和治疗中也具有重要意义。通过分析miRNA-136、miRNA-494 和miRNA-495 在外泌体内的表达可用于子痫早期诊断；体外模拟脑缺血微环境，采用脑缺血组织提取物刺激 MSCs 提取其外泌体，以此获得的MSCs-Exo 含有多种神经源性和血管生成因子，可用于治疗脑卒中[60]；另外，MSCs-Exo对难治性黄斑裂孔也具有促愈合作用，并且MSCs-Exo 还可用于治疗1 型糖尿病、心脑血管疾病、脑中风和骨关节炎等疾病；此外，因MSCs-Exo 特有的生物结构还可将其作为药物载体发挥治疗作用。所以，随着对MSCs-Exo 研究的深入，将促使其早日用于临床疾病的治疗。

众多研究表明，MSCs-Exo 能够模拟MSCs 的生物学功能，外泌体可以通过靶细胞以膜融合或者内吞作用释放生物活性物质，具有促进组织修复及调节免疫应答等作用；外泌体相比于MSCs 更稳定、更安全，而且体积小，不容易堵塞血管；还能穿过质膜，降低免疫排斥反应发生。而且，进一步研究发现，外泌体中的microRNA 是外泌体发挥免疫调节的关键因子，外泌体可同时诱导Th1 转变为Th2 细胞，并抑制Th17 细胞的分化，提示外泌体在治疗一些免疫性疾病上具有广阔的前景。另外，外泌体中含有多种蛋白质及生物遗传物质，因此可以将蛋白质和大分子遗传物质装载到外泌体上，这样外泌体将可成为理想的药物载体。总而言之，随着对外泌体的深入研究，外泌体将有可能替代MSCs 用于临床协助疾病的治疗和诊断。