食管鳞癌肿瘤干细胞与HIPPO/YAP信号通路的研究进展

林炯臻 综述 谢宇杰 审校

1.广东医科大学研究生院，广东 湛江 524000；2.高州市人民医院胸外科，广东 茂名 525200

食管癌是世界上发病率排第十一、死亡率第六的一种常见恶性肿瘤，但在我国，食管癌的发病率明显升高，发病率高居第六，死亡率排第四[1]。我国的食管癌与西方国家的食管癌病理类型差异较大，西方国家的食管癌病理类型以食管腺癌为主，而在我国，食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)占据着食管癌的总病理类型90%以上。食管鳞癌的生存预后差，5年生存率仅为20%左右[2]。食管鳞癌治疗的主要难点在于术后的复发转移、抗放化疗、无靶向治疗药物等。因此，对于食管鳞癌中具有较强的耐药性及复发转移能力的肿瘤细胞进行研究十分重要，而这些具有该特性的细胞群即被称为肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSC)。

肿瘤干细胞理论是目前解释肿瘤起源、发生及发展的公认热门理论，该理论认为肿瘤干细胞起源于正常组织干细胞的突变失控，这些极少数细胞群具有自我更新(self-renewal)能力及分化(differentiation)潜能，奠定了肿瘤发生及肿瘤耐药，并导致复发转移的基础。应用肿瘤干细胞特定的相关标志物可以鉴定及分离食管鳞癌肿瘤干细胞，其中包括CD44、ABCG2、CD90等[3]。另外，在体外应用成球培养等特殊细胞培养技术[4]及有限细胞成瘤动物模型等验证。目前多项研究表明HIPPO/YAP 信号通路、Hedgehog 信号通路、Notch 信号通路、Wnt/β-catenin 信号通路等是维持食管鳞癌肿瘤干细胞干性特征主要的信号调控通路。

1 食管鳞癌肿瘤干细胞的研究方法

肿瘤干细胞是一种具有自我更新能力的细胞，这意味着它们可以经过不对称的分裂，产生细胞团和多种分化的子细胞，从而形成大量的其他肿瘤细胞。在不同的肿瘤中，不同的生物分子标志物被用来检测和分离肿瘤干细胞[5-6]。首先在分选肿瘤干细胞方面，在食管鳞癌细胞的原代培养中，用CD44 干性标志物流式分选后的肿瘤细胞具有更强的生长、侵蚀等肿瘤干细胞干性特征[5]。乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH)也是一种富集肿瘤干细胞的重要方法，有研究表明用该方法分选后的肿瘤细胞，成球培养的自我更新能力增强，及对化疗药物产生抵抗[7]。其他的细胞分子标志物例如CD90、CD271 等也被用于食管鳞癌肿瘤干细胞的分选。但单一的细胞分子标志物并不能有效地分选肿瘤干细胞，多种细胞分子标志物的联合可以提高分选的效率。其次在检测肿瘤干细胞方面，由于肿瘤缺乏特异性表型与肿瘤干细胞相关，使得肿瘤干细胞检测很难被特异性检测。目前较有说服力的是侧群细胞分析法，该方法为多种肿瘤干细胞的分选提供一个很有应用价值的手段。侧群细胞分析法分离出来的旁群(side population，SP)，对其功能特征以及表面标志物分子进行研究后发现，它们比普通肿瘤细胞具有更强的致瘤能力、对化疗药物具有更强耐药性、更强的自我更新能力和多向分化潜能以及表达更多的肿瘤干细胞相关标志物[8]。目前在动物模型方面，有多种方法检测肿瘤干细胞，其中在免疫缺陷鼠体内移植肿瘤，能够复制肿瘤干细胞启动肿瘤发生、发展的能力，也被认为检测肿瘤干细胞干性特征存在的重要手段。

2 HIPPO/YAP信号通路与肿瘤的主要调节机制

HIPPO/YAP 信号通路最早被发现于果蝇器官大小调节的信号通路中，后来也发现了其在哺乳动物中的多种生命活动过程中发挥着核心的作用[9]。目前认为HIPPO/YAP 信号通路主要组成包括系列的核心激酶链：Mst1/2、Sav1、Mob1、Lats1/2，而上游的主要分子包括Mer、Kibra 等，经过上述的系列激酶的磷酸化作用，最终作用于下游核心效应因子Yes 相关蛋白(Yes-associated protein，YAP)；因此YAP 是该信号通路的核心组成，研究表明人类的YAP基因定位于染色体11q13 上，广泛表达于人体各组织中。YAP 不是直接与DNA结合而发挥生物学作用的，而是在进入细胞核后与特定的转录因子TEAD结合后启动系列的下游基因从而发挥恶性生物学行为。因此YAP 是一个癌基因，HIPPO/YAP 信号通路若失调后，YAP 则发挥其促进细胞增殖、转移、抗凋亡等恶性生物学能力。此外该生物学行为亦取决于YAP在细胞的定位，若YAP被磷酸化后，其滞留于细胞质中，因而被降解，不能进入细胞核中从而作用于下游的系列癌基因。正常生理条件下，该信号通路为激活状态，系列的激酶作用致使磷酸化后的YAP 与细胞质中的蛋白结合并滞留于细胞质中，后被泛素化降解，从而抑制YAP 的下游作用的癌基因促生长、促转移、化疗耐药等恶性生物学行为。相反，若YAP 的磷酸化水平降低，则促进YAP的表达水平上升与细胞核内表达上升，从而发挥其促进下游基因的系列作用。

越来越多的研究表明，细胞核内的YAP表达水平上升导致肿瘤的恶性生物行为，包括转移、维持干性行为[9]，其中包括乳腺癌、结直肠癌[10]、肺癌[11]及食管癌[12]等。临床预后相关方面，也有研究表明YAP的表达水平上升与肿瘤的低分化及不良预后等临床特征相关[13]。多项研究表明HIPPO/YAP 信号通路参与了肿瘤干细胞的多种恶性生物学行为，包括上皮间充质转换(epithelial-mesenchymal transition，EMT)、耐药性及自我更新能力等方面[14]。

EMT逐渐成为肿瘤干细胞表型的重要特征，同时也是启动肿瘤转移的重要生物学行为[15]。该理论认为肿瘤细胞劫持该机制，从而发展侵蚀、转移等能力，发生EMT 转换的癌细胞能够穿过内皮细胞，进入血液和淋巴系统，一旦到达合适的环境，就能通过一种称为间充质-上皮转变的逆转过程恢复上皮表型。许多研究已证实YAP被激活后，YAP通过激活TEAD转录因子作用于下游癌基因来促进EMT 发生从而促进肿瘤细胞的侵蚀、转移[16]。HIPPO/YAP信号通路的系列激酶或者磷酸化YAP 的失活，会导致EMT 相关分子标志物的改变，例如Vimentin 和N-cadherin 等上升，以及E-cadherin 的下降等。此外，EMT 诱导的相关转录因子Snail，也能结合YAP 维持肿瘤细胞的干性特征[17]。

耐药性是恶性肿瘤治疗失败的重要原因，研究表明具有较高YAP 表达水平的肿瘤细胞对化疗药物表现出耐药性，部分原因是YAP激活后肿瘤细胞获得的肿瘤干细胞特征[18]。同样对于肿瘤靶向治疗药物，已有研究显示靶向RAF 和MEK 的药物，HIPPO/YAP 信号通路激活后会导致这些治疗药物失效，因此，肿瘤干细胞的耐药性对于临床药物治疗肿瘤将是一项巨大的阻碍[19]。

以上各点都是HIPPO/YAP 信号通路参与各类肿瘤多种生物行为的重要过程，同时也说明了HIPPO/YAP 信号通路是维持肿瘤干细胞的多项生物特征的重要通路。也给肿瘤研究者提供一个新的方向，对于食管鳞癌肿瘤干细胞与HIPPO/YAP 信号通路作用的相关研究，可能是未来的潜在治疗手段。

3 HIPPO/YAP信号通路与食管鳞癌的研究及潜在治疗价值

最早有日本学者报道了YAP 是食管鳞癌的潜在癌基因，该研究表明YAP在食管鳞癌的癌组织中显著增高，同时YAP表达水平的上升和细胞核内的增加可促进肿瘤生长及导致不良的预后[12]。另外一项研究显示YAP能够上调Sox9的表达水平，而促使获得食管鳞癌的肿瘤干性特征，而通过降低YAP表达水平或者使用YAP的特异抑制剂，则使肿瘤干细胞的特征消失[20]。再者，YAP 能够调节EGFR 的表达水平从引起对于化疗药物的耐药，YAP 和EGFR 在耐药的食管癌组织中均高表达，并与肿瘤组织和细胞株中的耐药性获得有关，YAP-EGFR 信号通路轴可能是食管鳞癌重要的治疗靶点[21]。同时对于食管癌的放疗相关性研究表明，YAP 作为癌基因可通过介导CK6 引起食管癌的放疗抵抗[22]。对于MicroRNA与食管癌的HIPPO/YAP信号通路的研究，CHOE 等[23]有报道过MiR-550a-3-5p 通过直接抑制YAP 作为癌基因的作用来抑制食管鳞癌肿瘤干细胞多种特征，包括癌细胞的增殖、转移和自我更新能力等；同样另一项有关食管鳞癌的MicroRNA研究中，MiR-31可以通过介导HIPPO/YAP信号通路抑制LATS2 的表达和激活EMT 的转变，MiR-31 的高表达水平在食管鳞癌中起着重要作用，可以预测食管鳞癌的复发风险和预后的新型分子标志物[24]。这些研究都充分说明了HIPPO/YAP 信号通路是维持食管鳞癌肿瘤干细胞特征的重要信号通路，研究食管鳞癌肿瘤干细胞与HIPPO/YAP 信号通路的具体机制有望成为食管鳞癌干性相关的分子标志物及潜在的治疗靶点。

肿瘤干细胞理论认为靶向肿瘤干细胞治疗可能是根治肿瘤的最终手段，而HIPPO/YAP信号通路提供了一个重要的食管鳞癌潜在治疗靶点，但目前靶向HIPPO/YAP信号通路的研究尚处实验室水平，临床上仍未有相关的靶向药物应用于治疗食管鳞癌。这些包括了靶向激酶HIPK2 的治疗，通过激活P53 介导的DNA 损伤而发挥潜在的治疗目的[25]。直接靶向YAP的小分子抑制物，已经在动物实验中验证，其中包括抑制肝癌[26]及结直肠癌[27]等肿瘤的生长。维替泊芬(Verteporfin)从前作为一种光敏剂，后被作为直接靶向YAP的抑制物，已有动物实验应用维替泊芬阻断YAP表达，因此可抑制肝癌的生长[15]。另外一种YAP的抑制剂CA3，通过联合常规的食管鳞癌化疗药物5-FU，可以通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡、减少肿瘤球的形成等来抑制肿瘤干细胞的表型[28]。VGLL4 是一种HIPPO/YAP信号通路中YAP的拮抗剂，作为少数的细胞核内的抑制剂，VGLL4 和YAP 形成相互制衡，从而抑制其转录因子TEAD启动的下游相关的癌基因作用，从而抑制肿瘤的生长及转移，有望成为新型的有效手段来治疗YAP启动的相关肿瘤[29]。此外，他汀类药物亦可抑制肿瘤干细胞的干性特性，如肿瘤发生、转移、自我更新等。机制上的研究，他汀类药物与YAP 的抑制作用，与肿瘤的发生、发展的具体机制还有待进一步揭示，而这也有可能为靶向肿瘤干细胞治疗提供理论依据[30]。

4 小结

总体而言，肿瘤干细胞理论的提出使科学家对于肿瘤的认识有了更多的见解。尽管对于食管癌肿瘤干细胞的研究尚有许多问题有待解答，但食管鳞癌肿瘤干细胞的自我更新、耐药性等干性相关特征的研究已有陆续报道，这些研究表明肿瘤干细胞是肿瘤复发、转移及治疗失败的关键一步。而HIPPO/YAP信号通路近年来与肿瘤干细胞的关系尤为密切，目前已证实HIPPO/YAP 信号通路通过系列关键激酶及其核心的YAP基因而影响下游癌基因，最终发挥其恶性生物学行为，例如EMT、化疗及靶向治疗药物耐药等。人类对于HIPPO/YAP 信号通路与食管鳞癌的联系尚未清晰，具体的作用机制也有待进一步探究，但值得期待的是通过靶向HIPPO/YAP 信号通路有望为靶向肿瘤干细胞治疗提供一个有效的手段，但这需要对该信号通路的进一步研究。对于靶向HIPPO/YAP 信号通路的药物目前已有报道，其中包括了直接或间接靶向YAP 和TAZ 的分子抑制剂等，具体治疗手段包括单独治疗或联合放化疗使用等。这些抑制剂已在食管鳞癌的细胞水平及动物实验中取得一定的成果，但目前尚无一种靶向HIPPO/YAP 信号通路的药物应用于临床。食管鳞癌目前尚无一种靶向治疗药物应用于临床，而靶向HIPPO/YAP 信号通路是食管鳞癌治疗的潜在有效手段，通过充分研究阐述HIPPO/YAP 信号通路的具体机制，才能为最终的临床应用打好基础[31]。