淋巴细胞亚群检测及对结核病诊断和患者免疫状况评价的价值

吴雪琼

目前结核病(TB)依然是全球严重危害人类健康的慢性呼吸道传染病，是全球十大死因之一，是单一传染病的头号杀手。尽管研究显示85%～90%的活动性肺结核是由潜伏性结核感染(latent tuberculosis infectioin, LTBI)者发展而来的，但在全球约1/4的结核分枝杆菌(MTB)感染人口中，只有大约10%发病，90%终生不发病；而且TB具有家族聚集倾向，这些现象均说明人类在抗MTB感染方面存在遗传差异。近年来，已发现了一些结核感染和发病的易感基因，大多数与免疫系统和炎症反应相关，遗传差异导致TB患者免疫功能异常或免疫缺陷，影响机体抵抗MTB感染的效力。因此，目前已认识到TB不仅是一种细菌感染性疾病，也是一种免疫性疾病，机体对MTB的免疫识别、免疫应答和免疫调控决定了MTB感染后疾病的发生、发展和转归[1-2]。

目前，可应用于临床TB患者免疫功能评价的方法较少，主要有以下三类：(1)淋巴细胞亚群分析：包括淋巴细胞亚群的相对计数和绝对计数；(2)体液免疫功能分析：主要检测血液及体液中结核感染相关抗体；(3)细胞免疫功能分析：主要检测皮肤迟发型变态反应、细胞因子[如γ干扰素(IFN-γ)]水平和分泌IFN-γ的效应T细胞数。

淋巴细胞亚群已广泛用于其他疾病的免疫功能评价，但在TB临床应用不多，主要原因如下：(1)对TB患者免疫状况在疾病发生、发展中的作用认识不足，重视不够；(2)对这些免疫指标的临床意义尚不十分清楚；(3)仪器、试剂价格昂贵，技术要求高，大多数实验室条件有限，无法开展复杂的免疫检测试验。《中国防痨杂志》编委会于2019年5月23日在吉林省延吉市召开了淋巴细胞亚群检测共识讨论会，形成《结核病患者外周血淋巴细胞亚群检测及临床应用专家共识》，以便临床医师正确解读、客观分析、科学判断结果，从而合理制定综合的治疗方案，提高TB的诊断和治疗水平。笔者以下将重点探讨淋巴细胞亚群检测的进展、存在的问题和未来发展的前景。

淋巴细胞亚群检测技术的主要进展

1.检测技术发展[3]：1973年，Steinkmp通过激光激发双色荧光色素标记的细胞进行计数和分选，建立了流式细胞术(flow cytometry，FCM)；同年Herzenberg与斯坦福大学合作研发出世界上第一台商用流式细胞仪[荧光活化细胞分选(fluorescence activated cell sorting，FACS)仪]；20世纪80年代流式细胞术开始在临床研究与应用，淋巴细胞亚群分析相对计数法也开始用于各类临床疾病的免疫诊断和治疗监测[4]；20世纪90年代定量流式细胞分析技术的问世，使淋巴细胞亚群分析更准确，实现了对外周血淋巴细胞的绝对计数[5]。早期国内淋巴细胞亚群分析大多采用相对计数法，近年来部分实验室已同时开展相对计数法和绝对计数法[6]。随着流式细胞仪光学系统和试剂的进步，仪器可配备多个激发器和检测器，试剂出现更亮的新染料；多色流式细胞分析仪通过多种荧光抗体可以检测淋巴细胞在不同生长水平及分化水平所表达的细胞表面抗原和细胞内抗原，在单细胞水平可测定多个参数，使得单一样品可检测高达14 个参数，从而可能对淋巴细胞亚群的不同特征进行多方面的鉴定[7]。

2.检测指标增多：临床上淋巴细胞亚群分析由只分析T淋巴细胞的CD3、CD4和CD8，发展到分析B淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、自然杀伤T细胞(natural killer T cells，NKT细胞)；由只检测相对计数到绝对计数法；其他疾病进行相关检测时，还对CD4+和CD8+T细胞进行精细分型，如幼稚T细胞亚群、记忆T细胞亚群、T细胞功能亚群和T细胞激活亚群等，为临床患者提供较多的免疫评价指标。

3. 检测标本扩展：淋巴细胞亚群检测主要是检测外周血，后来发展到可检测胸腔积液和肺泡灌洗液[8-9]，以了解局部免疫功能。结核性胸腔积液以淋巴细胞为主，与外周血淋巴细胞结果相比，结核性胸腔积液表现为CD3+和CD4+T淋巴细胞亚群增多，CD4+/CD8+T淋巴细胞比值增加，B淋巴细胞百分比和绝对计数均减少[8,10]；NK 细胞的占比明显下降，其中CD56+CD16-NK 细胞亚群占比相对增加而CD56+CD16+NK 细胞亚群占比明显减少，而且NK 细胞高表达记忆相关分子CD45RO、低表达初始相关分子CD45RA，提示结核性胸腔积液中可能存在一群记忆性NK 细胞[10]。活动性肺结核患者肺泡灌洗液及外周血中CD4+T淋巴细胞亚群百分比及CD4+/CD8+T淋巴细胞比值均明显低于对照组(P<0.05)，而且患侧也明显低于健侧；患侧肺泡灌洗液中的NK 细胞水平也明显低于健侧 (P<0. 05)；肺泡灌洗液中CD8+T淋巴细胞亚群百分比明显高于外周血(P<0.05)，而且患侧明显高于健侧(P<0. 05)；但两侧CD3+T淋巴细胞百分比差异无统计学意义(P>0. 05)[9,11]。

淋巴细胞亚群百分比和绝对计数的关系

淋巴细胞亚群分析有两种方法，其中相对计数法是分析各亚群细胞占总淋巴细胞数的百分比，因此，结果易受各类细胞亚群变化的影响。而绝对计数法可了解各类细胞亚群的独立变化，一种淋巴细胞亚群绝对计数的变化不会影响其他细胞亚群绝对计数的变化；但可能影响淋巴细胞亚群相对计数的变化，如：大多数TB患者表现为CD4+T淋巴细胞绝对计数降低，导致其细胞百分比降低；CD8+T淋巴细胞绝对计数在TB患者中也会出现不同程度的降低，但其降低程度低于CD4+T淋巴细胞，因而相对计数时会出现CD8+T淋巴细胞百分比增高，CD4+/CD8+T淋巴细胞比值可能不变或者降低[12-13]。T淋巴细胞在总淋巴细胞中所占百分比较高(50%～84%)，因此T淋巴细胞绝对计数或百分比变化必然会引起NK、NKT及B淋巴细胞的百分比发生相应改变[14]。肺结核患者CD3+CD56+CD16+/-NKT细胞和CD19+B淋巴细胞亚群的百分比和绝对计数均明显低于对照组[15]。重症TB患者各淋巴细胞亚群绝对计数均出现降低，但各淋巴细胞亚群百分比可能没有明显变化，仍处于正常范围[16]。因此，只分析各淋巴细胞亚群的百分比不能客观、准确地反映TB患者的免疫功能状况，建议同时检测与分析淋巴细胞亚群的相对计数和绝对计数。

γ干扰素释放试验(IGRA)检测结果与外周血淋巴细胞及淋巴细胞亚群的关系

IGRA的两种成熟检测技术——酶联免疫斑点(ELISPOT)试验与酶联免疫吸附试验(ELISA)检测的敏感度均随着外周血淋巴细胞计数的降低而明显降低， ELISPOT试验结果相对ELISA而言较不受淋巴细胞计数的影响[17]。当外周血淋巴细胞数低于500个/ml时， ELISPOT试验的敏感度为81%，而ELISA的敏感度降为39%[17]。由此可见，在低淋巴细胞计数的情况下，ELISPOT试验优于ELISA。

CD4+T细胞和CD8+T细胞计数与外周血淋巴细胞数呈明显线性相关，CD4+T细胞是产生IFN-γ的主要细胞类型，少量CD8+T细胞也被诱导产生IFN-γ[18]。IGRA检测结果与CD4+T细胞和CD8+T细胞计数密切相关，IGRA检测阳性者的CD4+T细胞和CD8+T细胞绝对计数大多在正常范围，也就是说CD4+T细胞和CD8+T细胞绝对计数在正常范围患者的IGRA阳性率明显高于其他患者。IGRA对活动性肺结核的阳性预测值(PPV)很低[19]；IGRA最大的优点就是阴性预测值(NPV)非常高[20]，但CD4+T细胞和CD8+T细胞绝对计数明显低于正常范围的患者易出现假阴性结果，同时也会因为免疫低下而导致内源性复燃的风险增高[21]。因此，IGRA用于检测高风险人群的LTBI时，建议同时分析淋巴细胞亚群的绝对计数，以避免由于IGRA假阴性造成遗漏而导致活动性肺结核的发展[22]。

MTB/HIV共感染与淋巴细胞亚群的关系

人类G蛋白偶联因子超家族(GPCR)成员的细胞膜蛋白趋化因子CCR5是HIV-1入侵机体细胞的主要辅助受体之一。目前的研究发现，TB相关的慢性免疫激活可使患者机体CCR5+表达增强、CCR5+CD4+T细胞频率增高，从而导致HIV优先靶向MTB 特异的记忆性CD4+T细胞，使 MTB 特异的CD4+T细胞在HIV感染早期就从外周血中消失[23-25]。MTB/HIV共感染导致MTB特异性T细胞功能分层丧失，首先是白细胞介素(IL)-2+CD4+T细胞反应丧失，其次是肿瘤坏死因子(TNF)-α+CD4+T细胞丧失，IFN-γ+CD4+T细胞最后丧失，提示IL-2的分泌能力可能在TNF-α或IFN-γ之前首先丧失。HIV感染的LTBI者中MTB特异性CD4+T细胞的耗竭在IFN-γ+IL-2-TNF-α+亚群中最为明显，MTB特异的CD4+T细胞的快速耗竭使感染HIV的LTBI者患活动性TB的风险明显增加[26-27]。MTB特异性IL-2+TNF+或IFN-γ+CD4+T细胞数与HIV病毒载量呈负相关，MTB/HIV共感染者随着HIV-1感染病情的进展、免疫抑制增强会导致MTB特异性多功能CD4+T细胞反应丧失。HIV感染者中抗原特异性CD8 T细胞早期表现为CD27+/CD28+(早期分化表型)，随后CD28表达丧失(CD27+/CD28-，呈中间分化表型)，晚期CD27表达丧失(CD27-/CD28-，呈晚期分化表型)[28]。而MTB感染者正好相反，MTB特异性CD8 T细胞表现为CD28+高表达，CD27+低表达，首先是CD27表达丧失[27]。 MTB/HIV共感染会损害MTB特异性细胞免疫反应，不能在MTB激活下抑制其复制，导致疾病进程加快，极大地增加了活动性肺结核发病的风险。此外，CD4+T细胞对MTB呈现强反应的同时可能也增强了HIV的复制[29]，因此，MTB/HIV共感染者的HIV病毒载量一般高于单独HIV感染者，反复或持续的共感染明显增加了HIV病毒载量，从而增加HIV传播的风险和艾滋病的发病率[30]。

衰老与淋巴细胞亚群的关系

随着人体的衰老，发生免疫系统的衰退被称为免疫衰老，导致细胞免疫应答和体液免疫应答降低，外周血淋巴细胞亚群发生一系列变化；其中CD3+、CD4+和CD8+T细胞减少，记忆性CD4+、CD8+T细胞增多，T细胞CD28表达减少对于免疫系统的衰老具有重要意义[31-32]。CD8+T细胞会随着年龄的增长而下降，而且明显早于CD4+T细胞。CD28分子是效应CD4+和CD8+T细胞的重要共刺激标记物，在出生时几乎所有的T细胞都表达CD28，随着年龄的增长胸腺退化，与其相关的幼稚CD28+T细胞输出逐渐减少，至80岁50%～60%的CD8+T细胞失去CD28的表达，导致免疫表型减弱[33]。老年人CD8+CD28-T细胞的表达频率明显高于CD4+CD28-T细胞，CD28-T细胞虽然可增强细胞毒性和调节功能，但具有降低抗原受体多样性、抑制抗原诱导的增殖、缩短复制寿命的作用，可能导致老年人免疫功能低下，对新病原体和疫苗的反应受损[34]。因此，CD28-T细胞可作为老年人免疫功能不全的一个重要预测因子。相反，老年人NK细胞和CD19+B细胞的绝对计数和百分比可能变化不明显，但CD56+NK细胞百分比降低、CD56-NK细胞增加[31,35]；B细胞多样性明显下降，由于B细胞可产生抗体，也是有效的抗原递呈细胞，因此导致免疫力下降[36]。由此可见，对于老年TB患者进行淋巴细胞亚群分析，评价免疫功能，对于制定合理的综合治疗方案是非常需要的。

需建立新的基于多色流式细胞术检测T淋巴细胞亚群的方法

目前，TB临床检测淋巴细胞亚群的类型有限，对淋巴细胞亚群功能的评价不足，尚不能完全满足临床需求，需研发、开展新的针对TB患者临床免疫学特征的淋巴细胞亚群的分析指标和方法，以指导临床诊疗。如通过流式细胞术将T淋巴细胞分为中心记忆T细胞(T central memory，TCM)、效应记忆T细胞(T effector memory，TEM)、效应T细胞(T effectorcells，TE)和幼稚T细胞(naive T cells)，通过分析TEM/TCM 的比值可作为了解MTB感染的标志物，痊愈TB患者的TEM和TCM对早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)均有反应，而IFN-γ阴性个体只有TCM反应；TCM占优势者通常体内无MTB增殖，而TEM占优势者体内可能有MTB增殖[37]。

CD4+T细胞在TB患者抗感染免疫中发挥着重要的作用，可以作为一个相对独立的分析指标。CD4+T细胞根据其分泌的细胞因子和介导的功能不同可以进一步分为辅助性T淋巴细胞(Th细胞)1(Th1细胞)(IFNγ+CD4+)、Th2细胞(IL-4+CD4+)、Th17细胞(IL-17+CD4+)、Th9细胞(IL-9+CD4+)、Th22细胞(IL-22+CD4+)，以及具有免疫抑制功能的调节性T细胞(Treg，CD4+CD25+Foxp3+)等细胞亚群。IFN-γ+CD4+在与TB密切接触者和免疫抑制剂使用者中对LTBI诊断的敏感度明显高于IGRA和PPD皮肤试验[38]。此外，可从细胞免疫功能方面进一步精准地评估TB患者的免疫状态，如通过流式细胞术分析T细胞表面的细胞因子也可诊断MTB感染，如LTBI者的外周血单个核细胞(PBMC)中分泌IL-2/IFN-γ的CD4+T细胞比率明显高于活动性TB患者；活动性TB患者随着治疗好转、MTB载量下降，分泌IL-2/IFN-γ的CD4+T细胞比率也会逐步升高。应用多色流式细胞术评价MTB特异的CD4+或CD8+T细胞免疫激活标志物的表达，TB患者MTB特异的CD4+IFNγ+T细胞表达免疫激活标志物CD38、人类白细胞抗原DR等位基因(HLA-DR)和细胞内增殖标志物Ki-67的频率明显高于LTBI者[39]。最近发现Th17细胞的主要表面标志物CD161+T细胞在活动性TB患者中明显低于LTBI者和正常人[40]，这些标志物可能能够鉴别活动性TB和LTBI。

细胞免疫应答在抗结核免疫中发挥了关键作用，未来随着流式细胞术的进步与推广将会极大地促进TB诊治各领域的发展，如TB诊断试验的建立、基础免疫的了解、疫苗接种效果的评估等[41]，也许能够解决全面评价TB患者淋巴细胞亚群表型和功能分析的难题。FACS可能成为诊断TB、判断疾病严重程度和治疗效果的重要手段之一。