中间型极限pH值牛肉嫩度劣变机制的研究进展

孔 潇，罗 欣,2，朱立贤，宋恩亮，张文华，张一敏,*

（1.山东农业大学食品科学与工程学院，山东 泰安 271018；2.江苏省肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心，江苏 南京 210095；3.国家肉牛牦牛产业技术体系济南综合试验站，山东 济南 250000；4.国家肉牛牦牛产业技术体系中卫综合试验站，宁夏 中卫 755000)

动物宰后，营养和氧气供给终止，肌糖原的有氧分解转化为无氧酵解，该过程产生乳酸，同时ATP在消耗过程中分解产生H+和无机磷酸根离子，使得肌肉pH值下降，随着酸性环境的增强，催化肌糖原无氧酵解的酶会逐渐失去活性，此时，肌糖原无法继续分解产生乳酸，肌肉的pH值也不再降低，这个pH值称为极限pH值（ultimate pH，pHu）[1-2]。动物宰后正常pHu一般在5.4～5.8之间。如果动物宰前受到应激，会出现较高或较低的pHu。较高pHu的肉也称为DFD（dark, firm, dry）肉或“黑切肉”，其pHu一般大于6.2[3]；也有部分肌肉的pHu在5.4以下，称为PSE（pale, soft, exudative）肉[4]，由于PSE肉在牛肉中较少出现，因此，本文不对PSE肉进行讨论。

根据现有对不同pHu牛肉的研究，一般将牛肉分为3 个组别：高pHu组（pHu＞6.2）、中间型pHu组（5.8＜pHu≤6.2）和正常pHu组（5.4≤pHu≤5.8）。不同pHu组中牛肉的嫩度以及成熟过程中的嫩化速率存在明显差异。Wu等[5]将牛肉真空包装后贮藏28 d，在不同时间点对剪切力进行测定，结果表明高pHu组牛肉剪切力最小，其次是正常pHu组，中间型pHu组在整个成熟过程中都表现出较高的剪切力。Li Peng等[6]对宰后1～9 d牛背最长肌的剪切力进行分析，发现高pHu组牛肉在宰后1 d即达到较好的嫩度，且其在整个成熟期间的嫩度都要优于正常、中间型pHu组；宰后1 d，正常、中间型pHu组牛肉的剪切力没有显著差异，但随着成熟的进行，正常pHu组剪切力的下降速率要明显高于中间型pHu组。以上研究表明，中间型pHu牛肉的嫩度较其他pHu牛肉易发生品质劣变，这对牛肉产业造成巨大的经济损失，但产生这种现象的机制目前尚不明确。因此，本文将从与嫩度有关的细胞骨架蛋白的降解、内源酶以及小热休克蛋白（small heat shock proteins，sHSPs）在中间型pHu牛肉中的表达特性入手，阐述pHu对以上因素的影响，进而综述中间型pHu牛肉嫩度劣变的机制，为改善中间型pHu牛肉的嫩度提供科研思路。

1 细胞骨架蛋白的降解

肉的嫩度是由结缔组织的含量和溶解度、宰后僵直过程中的肌节收缩程度以及宰后肌原纤维结构的破坏、相关肌原纤维蛋白的降解程度决定的。其中宰后肌肉中肌原纤维蛋白和细胞骨架蛋白的降解是肌肉嫩化的主要原因[7-8]。这些骨架蛋白包括肌联蛋白、肌间线蛋白及肌钙蛋白-T，它们结构的微小变化或降解，都可能导致骨骼肌结构的变化，从而使肉的嫩度发生较大变化[5]。目前，已有很多学者对这些蛋白在不同pHu肉中的降解情况进行研究，发现不同pHu肉中蛋白的降解程度及降解速率存在显著差异。

1.1 肌联蛋白的降解

肌联蛋白又叫伴肌球蛋白，是肌肉中除肌动蛋白和肌球蛋白以外含量最多的蛋白。其整个分子跨越肌节的一半，C端固定于M线，N末端与Z线交迭[9]。肌联蛋白的主要作用是稳定肌球蛋白粗丝，从而保持整个肌节的完整性[10-11]。肌联蛋白的降解会破坏肌节的纵向结构以及肌肉的完整性[12]。嫩度的变化与肌联蛋白的降解紧密相关[13]。Koohmaraie[7]通过观察宰后蛋白质降解对肌肉超微结构的影响，认为肌联蛋白和肌间线蛋白是决定肉嫩度的关键底物。

Lomiwes等[14]对肌联蛋白在3 个不同pHu组间的降解情况进行观察，结果显示高pHu牛肉在宰后2 d已检测不到完整的肌联蛋白，而中间型pHu牛肉宰后7 d仍存在完整的肌联蛋白；此外，正常pHu牛肉的肌联蛋白在宰后1 d开始发生降解，而中间型pHu牛肉则在宰后2 d才可找到T2降解条带；以上结果均可说明，肌联蛋白在中间型pHu组牛肉中所起到的嫩化作用较低。这一现象与中间型pHu牛肉中较低的钙蛋白酶和组织蛋白酶活力有关[14]。

1.2 肌间线蛋白的降解

肌间线蛋白是一种十分重要的细胞骨架蛋白，其与Z线相连并将Z线与其他细胞骨架原件连接起来[15]。肌间线蛋白的主要作用是防止肌肉收缩时肌节被过分拉伸，并在Z线位置将邻近的单个肌原纤维连接起来，整合肌肉的收缩运动，有效维持肌细胞的完整性。肌间线蛋白在宰后肌肉成熟过程中迅速降解，可作为宰后整体蛋白水解的指标[15]。

肌间线蛋白在不同pHu肌肉中的降解程度和降解速率存在显著差异。Li Peng等[6]对比了不同pHu鲁西黄牛背最长肌宰后前9 d肌间线蛋白的降解情况，结果显示，完整肌间线蛋白的分子质量为54 kDa，其在成熟过程中会产生分子质量为50、47、41、39、34 kDa的降解产物，高pHu牛肉在宰后0.5 h～3 d即有以上降解产物的生成，正常pHu牛肉在宰后3 d开始出现39 kDa的降解条带，而中间型pHu牛肉在整个成熟过程中，肌间线蛋白几乎没有发生降解。肌间线蛋白的降解主要与钙蛋白酶有关[16]，而中间型pHu牛肉中钙蛋白酶活力不高，从而对该组的蛋白降解产生影响。

1.3 肌钙蛋白-T的降解

肌钙蛋白-T是肌钙蛋白与原肌球蛋白结合的亚基，其分子质量为35 kDa，在宰后成熟期间主要降解为30 kDa的产物[17-18]。研究发现，随着成熟时间的延长，30 kDa的产物含量增加，肉的嫩度也逐渐提高[6]。

Pulford等[19]为观察不同pHu牛肉成熟过程中的蛋白降解差异，选取了肌间线蛋白和肌钙蛋白-T两种代表蛋白进行免疫印迹分析，发现肌间线蛋白和肌钙蛋白-T在中间型pHu牛肉中的降解均迟于高、正常pHu牛肉，中间型pHu牛肉在宰后3 d才出现肌钙蛋白-T的降解产物。Contreras-Castillo等[20]也借助免疫印迹方法考察了安格斯杂交公牛背最长肌宰后28 d内肌钙蛋白-T的降解情况，结果表明肌钙蛋白-T在高pHu牛肉中的降解速率较快，其降解条带B2在宰后早期就可检测到，而在中间型、正常pHu牛肉中，宰后7 d才可检测到B2条带。除此之外，高pHu牛肉中肌钙蛋白-T的快速降解可能与其中较高的μ-钙蛋白酶活力有关。此外，肌钙蛋白-T在正常pHu牛肉中的可溶性更好，这也使其在不同pHu牛肉中的降解速率出现差异[21]。

从以上3 种细胞骨架蛋白的降解情况可以看出，肌联蛋白、肌间线蛋白和肌钙蛋白-T在高pHu牛肉中的降解速率较快，这些蛋白的降解使得高、正常pHu牛肉可较快达到消费者能够接受的嫩度。而中间型pHu牛肉中，细胞骨架蛋白的降解速率明显低于其他2 组，这导致了该组牛肉的嫩度较差，也使得该组牛肉需要更长的成熟时间才能达到理想嫩度。细胞骨架蛋白的降解差异主要是由在不同pHu牛肉中内源酶活性及sHSPs含量的差异引起的。通过观察这些蛋白的降解程度，可为中间型pHu牛肉找到确切的成熟时间，使肉品达到理想嫩度[19,22]。

2 肌肉pHu与内源酶系统

宰后肌肉嫩度的改善与成熟过程中肌原纤维蛋白的降解有关[23]，内源酶的水解作用在蛋白降解过程中发挥了重要作用。目前研究较多的与肌肉嫩化有关的酶类包括：钙蛋白酶、组织蛋白酶、细胞凋亡酶与蛋白酶体[24]。这些酶的含量以及活力会受到肌肉pHu的影响，当前的研究主要集中在不同pHu肉中的μ-钙蛋白酶和组织蛋白酶B的含量及活力差异，以及这些差异对嫩度的影响。

2.1 钙蛋白酶系统

钙蛋白酶是一类存在于细胞中的钙依赖性半胱氨酸蛋白酶。μ-钙蛋白酶和m-钙蛋白酶是已鉴定出的15 种不同编码基因钙蛋白酶中表征最好的2 种亚型[25]。m-钙蛋白酶需要毫摩尔水平的Ca2+才能被激活，而μ-钙蛋白酶只需要微摩尔水平的Ca2+即可被激活[24]。此外，Geesink等[26]发现在m-钙蛋白酶被激活的情况下，μ-钙蛋白酶基因缺陷小鼠的宰后蛋白水解程度低于正常小鼠，说明μ-钙蛋白酶是导致宰后肌原纤维蛋白水解的主要内源酶，利于宰后肌肉嫩度的改善。μ-钙蛋白酶由一个80 kDa的催化亚基和一个28 kDa的小亚基组成。μ-钙蛋白酶的激活伴随着自溶的发生[27]，80 kDa的亚基先降解至78 kDa，78 kDa亚基还具有较高的蛋白水解活力，但当其进一步降解至76 kDa时，μ-钙蛋白酶活力丧失[28]。

μ-钙蛋白酶活力在不同pHu肉中存在差异。Pulford等[19]对牛背最长肌中μ-钙蛋白酶和m-钙蛋白酶的活力进行测定，结果显示，宰后1 d高pHu牛肉的μ-钙蛋白酶含量约为正常pHu牛肉的2 倍，这种差异一直持续到宰后8 d。当在15 ℃条件下贮存时，与高pHu牛肉相比，中间型、正常pHu牛肉的钙蛋白酶活力较小，这与μ-钙蛋白酶的最适pH值在中性附近有关。Lomiwes等[14]对宰后0～28 d牛肉中的μ-钙蛋白酶进行免疫印迹分析，发现在高pHu组中μ-钙蛋白酶在宰后0 d即发生自溶，正常pHu组在宰后14 d只能检测到76 kDa亚基的存在，而中间型pHu组中该酶的自溶时间要晚于正常、高pHu组，且宰后28 d仍能检测到78 kDa亚基的存在。这说明μ-钙蛋白酶在中间型pHu组发挥水解作用的时间迟于其他2 组，从而使中间型pHu牛肉的嫩化速率低于正常、高pHu牛肉。

钙蛋白酶系统除了不同亚型的钙蛋白酶外，还包括钙蛋白酶抑制蛋白，其是钙蛋白酶的特异性内源抑制剂。有钙蛋白酶存在的组织都含有钙蛋白酶抑制蛋白[27]。通过对钙蛋白酶系统参与肉嫩化的模型可以看出，高水平的钙蛋白酶抑制蛋白可以抑制钙蛋白酶活力，从而减少与嫩度有关的细胞骨架蛋白的降解，使肉的嫩度变差[29]。在宰后24 h后，肉中钙蛋白酶抑制蛋白的活力与肉嫩化的程度有关，钙蛋白酶抑制蛋白的活力差异可导致肉的嫩度差异高达40%[30]。

2.2 组织蛋白酶

组织蛋白酶是研究肉嫩化机制所涉及的第一个酶系统[31]。组织蛋白酶存在于溶酶体中，由一系列内肽酶和外肽酶组成，包括半胱氨酸肽酶（组织蛋白酶B/H/L/X）、天冬氨酸肽酶（组织蛋白酶D/E）以及丝氨酸肽酶（组织蛋白酶G）[32]。内源酶对嫩度产生影响，发生在该酶与肌原纤维蛋白接触的前提下[33]，但由于组织蛋白酶受到溶酶体的制约，不易与肌原纤维蛋白接触，因此，很多学者对组织蛋白酶可影响嫩度这一说法产生质疑。但随着研究的深入，发现当胴体pH值较低、温度较高时，溶酶体膜被破坏、稳定性降低释放出组织蛋白酶，从而可改善肉的嫩度。Tian Jiachun等[34]研究发现，宰后成熟过程中牦牛肉的pH值和保水力等理化特性的变化以及组织蛋白酶B、L、H活力的上升均会对嫩度产生影响。

中间型pHu牛肉的组织蛋白酶活力明显区别于其他pHu牛肉。Pulford等[19]采用荧光法对牛背最长肌中组织蛋白酶B活力进行检测，结果显示，三组牛肉在宰后22 h内组织蛋白酶B活力都较低，宰后2 d酶活力均成倍增加，此后正常pHu组中组织蛋白酶B活力始终高于中间型和高pHu组，且酶活力增加趋势可持续到宰后8 d，但在中间型pHu组中，组织蛋白酶B活力在宰后5 d开始下降。除此之外，Lomiwes等[35]认为溶酶体膜在高pH值条件下较为稳定，增加了组织蛋白酶与肌原纤维蛋白接触的难度，且组织蛋白酶在pH 5.0～6.0之间活力最高，因此其在正常pHu组中对牛肉嫩化的贡献程度要远高于中间型和高pHu组。在中间型和正常pHu牛肉的成熟过程中，钙蛋白酶活力不存在明显差异，但组织蛋白酶B活力的差异使得两组牛肉的嫩化速率不同，中间型pHu牛肉的嫩度劣于正常pHu组[16]。

2.3 细胞凋亡酶系统

细胞凋亡酶是一类介导细胞凋亡的半胱氨酸-天冬氨酸特异性蛋白酶，由14 个成员组成[29]。该系统可被分为三大类：第一类为启动子，包括细胞凋亡酶8/9/10/12，负责启动细胞凋亡；第二类为效应子，包括细胞凋亡酶3/6/7，可对特定底物起到降解作用。启动子和效应子主要在细胞凋亡过程中发挥作用。第三类为炎症组，可以诱发炎症，包括细胞凋亡酶1/4/5/13[33]。

细胞凋亡酶3和细胞凋亡酶7一旦被激活，就会靶向切割特定的底物（包括肌原纤维蛋白和细胞骨架蛋白），导致细胞凋亡[36-37]。此外，细胞凋亡酶3可直接水解钙蛋白酶抑制蛋白。因此，有学者认为细胞凋亡酶可能直接通过细胞凋亡酶介导的肌原纤维蛋白降解和/或其在细胞凋亡中的关键作用，促进宰后蛋白质的降解和肉的嫩化[29]。

目前，pHu对细胞凋亡酶影响的研究还较少。正常pHu牛肉中细胞凋亡酶3/7的活力始终高于中间型和高pHu牛肉，这表明正常pHu牛肉有更高的细胞凋亡率。在宰后第3小时，正常pHu牛肉的细胞凋亡酶3/7活力显著升高，因此，通过对细胞凋亡酶3/7活力的测定可以在宰后早期对肉质的优劣进行预测[19]。细胞凋亡酶诱导细胞凋亡有3 条通路，其中一条通路为线粒体通路，线粒体通过释放细胞色素c参与细胞凋亡过程。细胞色素c的释放受到Ca2+的调控，Ca2+浓度越高，线粒体稳定性越差，从而有利于细胞色素c的释放[16,38]。当pH值较低时，肌浆网的钙泵功能失调，细胞质中的Ca2+浓度增加，这一过程虽会在宰后初期引发僵直，但细胞凋亡率同时也增加，随着贮藏时间的延长有利于正常pHu牛肉的嫩化。而中间型pHu牛肉的pH值偏高，这一进程的推进远不及正常pHu组，导致其嫩化速率较慢。

2.4 蛋白酶体

蛋白酶体是一种蛋白酶复合体，含有多个亚单位，因其沉降系数为26S，故又称为26S蛋白酶体[33]。蛋白酶体含有一个20S的催化亚基，其水解底物时需要ATP的参与，当ATP消耗殆尽时，蛋白酶体就会解离出20S蛋白酶体[33]。在早期研究中，研究人员发现当肉处于正常pH值时，蛋白酶体的作用有限，其活性pH值要高于正常pH值[39]。因此，蛋白酶体能否影响肉的嫩度仍待确定。随着研究的深入，Thomas等[40]对鸵鸟肉中的20S蛋白酶体活力进行测定，发现20S蛋白酶体在贮藏12 d后仍能保持较高的活力。并且蛋白酶体在体外条件下仍能发挥水解作用，使肌球蛋白、肌动蛋白和伴肌动蛋白发生降解。同时当蛋白酶体的活性受到抑制时，肌钙蛋白-T和伴肌动蛋白的降解程度明显降低[41]。目前有关不同pHu肌肉中蛋白酶体活力的研究还较少，Sentandreu[32]和Dutaud[39]等提出，蛋白酶体在高pHu下可以破坏肌原纤维中的Z线，这表明了该酶可在高pHu肉的早期嫩化过程中发挥作用。

目前，关于中间型pHu牛肉嫩度劣变的机制研究，越来越多的学者将目光聚焦于内源酶系统，特别是钙蛋白酶和组织蛋白酶B。综合上述结果，发现高pHu牛肉中钙蛋白酶活力较好，正常pHu牛肉中组织蛋白酶活力较好。而中间型pHu牛肉中2 种酶活力均处于中等水平。较好的酶活力促进细胞骨架蛋白降解，从而有利于牛肉的嫩化，而中间型pHu牛肉中缺乏一种在该pH值范围内活力较好的内源酶，这在一定程度上造成了该组牛肉嫩度的劣变。但单一内源酶活力的研究不足以解释不同pHu间主要肌肉蛋白降解差异产生的原因，更不足以解释中间型pHu牛肉嫩度劣变的原因，且以上列举的多数与嫩度有关的酶尚鲜有研究涉及。因此，对于不同内源酶之间的互相作用以及这些内源酶对中间型pHu牛肉嫩度劣变的影响程度，仍需要更深层次的探索。

3 肌肉pHu与sHSPs

HSPs又称为热应激蛋白，是指当环境温度高于生物体正常生长温度或生物体受到剧烈震荡时，为保护机体而产生或过表达的一种蛋白质[16,42]。sHSPs是HSPs族中分子质量最小的一类，其分子质量在12～43 kDa之间。sHSPs在生物体中具有十分重要的作用。在成熟过程中sHSPs可作为分子伴侣，防止肌原纤维蛋白降解[43]。sHSPs可以抑制肌动蛋白聚合以及调节肌动、肌球蛋白的相互作用，对肌动蛋白细丝构成的细胞骨架结构起到稳定和修复的作用[42]。此外，sHSPs还可以维持细胞稳态，抑制细胞凋亡[44]。

3.1 sHSPs对嫩度的影响

sHSPs在宰后成熟过程中会对肉品质，尤其是嫩度产生影响。Ouali等[31]首次提出sHSPs通过影响宰后肌细胞凋亡的过程，对肉品质产生影响。HSP20、HSP27和αβ-晶体蛋白在牛肉中的表达水平较高，这在一定程度上会造成牛肉终嫩度的变化[45]。很多研究表明，sHSPs表达水平的升高会影响蛋白水解过程，从而导致肉类嫩度变差[46-47]。Bernard等[48]通过研究编码HSP27的基因HSPB1以及编码αβ-晶体蛋白的基因CRYAB发现，HSP27和αβ-晶体蛋白表达上调，会使肉的嫩度变差。Lomiwes等[14]使用酶联免疫吸附测定对牛背最长肌中的HSP27、HSP20以及αβ-晶体蛋白进行定量分析，认为sHSPs在不同pHu组间含量存在差异，从而对μ-钙蛋白酶的水解活性产生不同程度的抑制作用。总结来说，sHSPs主要从三方面影响肌原纤维蛋白的降解。一是sHSPs可与部分内源酶结合，从而降低其水解活性，限制肌原纤维蛋白的降解；二是sHSPs可以延缓细胞凋亡酶靶蛋白的降解，细胞凋亡酶3可以很快使肌钙蛋白-T发生降解，但当加入HSP27后，肌钙蛋白-T的降解水平明显降低；三是sHSPs可以修复蛋白质的受损结构，使它们恢复原有的活性[49]。

3.2 pHu对sHSPs表达的影响

sHSPs的表达与肉pHu之间也存在一定的联系，这种联系进一步对肉的嫩度产生影响。Pulford等[50]对宰后0～22 h内3 组pHu牛肉中sHSPs的含量以及降解情况进行分析，发现宰后6 h内，sHSPs的含量是动态变化的，HSP20和αβ-晶体蛋白在中间型pHu牛肉中含量最高。中间型pHu（5.7～6.3）牛肉在宰后早期产生的应激sHSPs表达量最大，且宰后22 h仍存在大量的可溶性sHSPs。Lomiwes等[43]观察到宰后成熟期间sHSPs含量降低的程度与肌肉pHu有关，高pHu组肌肉在宰后2 d仍含有较高含量的sHSPs，其次是中间型pHu组，正常pHu组中的sHSPs因酸性环境而发生聚集，从而含量最低。但高pHu组中sHSPs可作为μ-钙蛋白酶的底物，在此pH范围内，μ-钙蛋白酶活力较高，使得sHSPs随着宰后成熟的进行被逐渐降解，进而使得该组sHSPs的活力降低。因此，虽然中间型pHu组μ-钙蛋白酶和组织蛋白酶B的活力不高，但高含量的sHSPs可结合μ-钙蛋白酶，并作为分子伴侣稳定肌原纤维结构，使得该组肉的嫩度较差。Balan等[45]通过对比正常pHu与中间型pHu牛肉中HSP20、HSP27的降解情况，发现与正常pHu牛肉相比，中间型pHu牛肉在宰后1 d完整的sHSPs含量最多。

此外，sHSPs可以通过抑制细胞色素c的释放来降低细胞凋亡酶的活力。中间型pHu牛肉中sHSPs表达的上调可阻止效应子细胞凋亡酶3/7活化，从而导致细胞程序性死亡的速率变慢[36]。这也可能在一定程度上导致了中间型pHu肉嫩化速率的降低[43]。

通过前人的研究，可以发现sHSPs与很多酶相互作用。一是sHSPs可以作为μ-钙蛋白酶的替代底物；二是sHSPs可以阻断细胞凋亡酶的激活通路，从而可减少钙蛋白酶对细胞骨架蛋白的降解以及肌细胞的凋亡。除此之外，sHSPs作为一种应激蛋白，具有分子伴侣功能，可结合肌原纤维从而起到保护肌原纤维的作用。而中间型pHu牛肉中sHSPs含量较高，因此，中间型pHu牛肉嫩度劣变与sHSPs密不可分。

4 结 语

嫩度是评价生鲜肉品质的一个关键指标，也是影响消费者购买意愿的重要因素。近10余年来，有关pHu对嫩度影响的研究越来越多。众多研究表明，与高、正常pHu牛肉的嫩度相比，中间型pHu牛肉的嫩度较差，其在宰后成熟过程中的嫩化速率较其他两组也较慢。就目前的研究来讲，对这一现象的机制研究主要集中在细胞骨架蛋白的降解、内源酶的活力及降解以及sHSPs的应激情况。当前关于蛋白质降解情况和sHSPs变化情况的研究较为透彻，但对酶活力以及sHSPs与多种内源酶之间互作关系的研究还较为缺乏，仍需要更进一步探索。近年来，蛋白质组学正逐渐被应用于这一研究领域中，通过寻找差异蛋白有望获得中间型pHu牛肉产生嫩度差异的原因。此外，不同pHu牛肉宰后0～24 h内的能量代谢特征仍未有研究涉及，因此是否能够通过代谢组学的手段对中间型pHu牛肉宰后0～24 h的代谢产物进行检测，以从中找出其嫩度劣变的原因，也是该领域研究的一个新思路。这一机制的研究是改善中间型pHu牛肉嫩度的理论基础，在对其机制清楚认知的基础上，找出切实有效、可应用于生产的改善方法是未来研究的重点。