单倍体胚胎干细胞的研究进展及应用前景

徐希桥，徐家伟，王海松，孙莹璞*

(1.郑州大学第一附属医院生殖医学中心，郑州 450000；2.河南省生殖与遗传重点实验室，郑州 450000；3.河南省妇产疾病(生殖医学)临床医学研究中心，郑州 450000；4.胚胎植入前遗传学诊断与筛查河南省工程实验室，郑州 450000)

正常情况下，哺乳动物体内只有减数分裂后的配子是单倍体，其他细胞均为二倍体，即一套染色体来自于母亲，一套染色体来自于父亲。一方面，从进化角度和生物多样性角度看，单倍体精子与卵细胞融合产生的二倍体哺乳动物具有诸多优势，既能有效防止隐性的有害突变导致生物体的淘汰[1]，维持种群数量的稳定，也能通过种间杂交增加遗传多样性，促进新物种的产生。但是另一方面，二倍体细胞的复杂结构阻碍了人们在二倍体细胞基因功能研究、印记基因调控和基因筛选方面的应用。而单倍体细胞既有单倍性，也有类似于二倍体的多能性和强大的分化潜能，能在体外实现自我更新。因此，单倍体细胞在探究基因功能、表观遗传修饰、研究配子发育过程、生成多基因修饰动物模型等方面具有独特优势[2]。本文就单倍体胚胎干细胞(haESCs)的特性、获取及其发展过程中遇到的问题进行思考并对其在各个领域的应用进行总结。

一、haESCs的获取及特性

1.体外诱导获取haESCs：单倍体细胞只含有一套染色体组，不含等位基因，因此在研究生物表型与基因关系以及基因筛选方面具有较高价值。但是由于单倍体细胞有存活能力弱、自发二倍化等特性，其稳定细胞系的建立经历了一个曲折的过程。早期探索过程中，单倍体细胞的自发二倍化特性使研究者难以获得稳定的单倍体胚胎干细胞系，这也成了发展过程中困扰人们的最大问题。曾有研究者利用从慢粒细胞白血病患者骨髓中获取的名为KBE-7的细胞株，通过连续亚克隆的方式分离出了“近单倍体”的细胞系，其染色体中除了8号染色体为两条，其余皆为一条[3]。然而由于该细胞系来源于癌细胞且基因组不稳定，限制了其在功能研究中的应用。

直到2009年，haESCs研究取得了重大进展，较为稳定的脊椎动物单倍体胚胎干细胞系成功建立，该细胞系来源于青鳉鱼胚胎[4]，为单倍体研究打开了一扇全新的大门。2011年，Elling等[5]和Leeb等[6]两个研究小组用不同的方法建立了小鼠孤雌胚胎干细胞系，实现了体外建立高等哺乳动物单倍体细胞系“零”的突破。其相同点在于均使用化学手段处理未受精的卵母细胞，模拟精子进入卵母细胞过程中引发的钙振荡，使卵母细胞孤雌激活，然后收集囊胚期胚胎。之后使用流式细胞荧光分选术(FACS)分选并富集haESCs，不同点在于Elling等[5]采用体内途径获取囊胚，即将卵母细胞激活后移植到假孕母鼠体内，再富集囊胚期内细胞团的细胞扩增并进一步分选，而Leeb等[6]采取体外途径获取囊胚，即在体外使用2i培养基(含有与凋亡相关的两条通路——激酶Mek通路和激酶GSK3通路的抑制因子)将胚胎培养至囊胚期并进行同样的分选流程。通过这两种方式获取的haESCs可以稳定保持单倍体性，其形态与正常二倍体胚胎干细胞相似，可表达经典的胚胎多能性标记基因并且具有分化为三胚层及完整组织的潜力。尽管实验存在局限性，但是稳定的小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞系的建立为进一步研究奠定了基础。2012年，小鼠孤雄单倍体胚胎干细胞相继在中国的两个课题组建系成功[7-8]，并且其替代精子产生成子代的能力得到了证实。在此之后，猕猴和大鼠的haESCs也建立起来，增加了将其他种类哺乳动物单倍体细胞用于基因研究的可行性[9-10]。2016年，Sagi等[11]和Zhong等[12]的研究组分别用MⅡ期卵母细胞化学激活法和显微外科手术法首次建立了人类孤雌单倍体胚胎干细胞系，并且验证了其基因组的完整性和分化潜能。4年后，获取难度相对更高的人孤雄单倍体胚胎干细胞系由中国学者建系成功，Zhang等[13]利用改良的显微操作技术成功建立了人孤雄单倍体胚胎干细胞系，并证明其具有使卵母细胞受精并发育至囊胚的能力，填补了haESCs的最后一块空白。除了具备分化潜能外，该细胞还具有与配子相似的生殖功能，可通过胞浆内孤雄单倍体胚胎干细胞注射技术(ICAHCI)将遗传修饰从细胞水平传递到个体水平，单倍体细胞系的建立为人类遗传学的发展提供了一种全新的工具。此外，haESCs具有强大的自我更新能力，能够兼容先进的基因编辑方法，可用于生成含纯合等位基因的哺乳动物细胞，从而使人们能够全面地研究隐性基因功能。

2. 稳定单倍体胚胎干细胞系的分选方法：迄今为止，由于存在自发的二倍化，单倍体的长期维持仍需通过FACS来富集单倍体细胞，这是一个复杂的过程。首先用Hoechst 33342对胚胎干细胞进行染色[14]，在波长355 nm的激光照射下，细胞核放射出波长为461 nm的荧光，然后使用流式细胞仪根据核酸含量进行单倍体细胞富集。其原理是当染色后的胚胎干细胞通过流式细胞仪时，其散发的荧光会被捕捉到，之后流式细胞仪捕捉光信号并进一步对数据进行分析，单倍体的DNA含量只有二倍体的一半，因此荧光信号也明显弱于二倍体细胞。根据这一特点，在流式细胞仪中可将细胞分为3个峰，分别为1C(G0/G1期单倍体细胞)、2C(G2/M期单倍体细胞和G0/G1期二倍体细胞)和4C(G2/M期二倍体细胞)，1C峰便是我们所需的单倍体细胞，通过这种方法可以较为精准地将单倍体细胞分离出来[15]。但流式细胞术是一种依赖于大型设备、高成本且复杂的技术，并且Hoechst 33342染料与紫外照射存在的细胞毒性会降低存活率，影响获取效率[16]，这些局限性限制了FACS的广泛应用。近期，有研究者利用不同脱氧核糖核酸含量的细胞之间存在明显的大小差异这一原理开发了简化的过滤方法来富集单倍体细胞，即通过定期过滤将直径较小的单倍体细胞与二倍体细胞分离，操作方法相对简便，对细胞的物理损伤小，经济适用，为获取稳定的单倍体胚胎干细胞系提供了全新的选择[17-18]。

3. haESCs的特性：haESCs与传统的二倍体胚胎干细胞具有一些共同的特征，如无限的自我更新能力和多能性。除此以外，孤雄单倍体胚胎干细胞还拥有与精子类似的功能，可以使卵母细胞“受精”，已经证明往卵母细胞胞浆内注射孤雄单倍体胚胎干细胞可支持小鼠和大鼠胚胎的足月发育。同时，在孤雄单倍体胚胎干细胞中模拟精子的印记状态，并通过注射到卵母细胞后可有效地产生具有预期遗传特性的小鼠模型[8，10，19]，因为通过这种方式获取的小鼠只含有一半的父源遗传物质，所以这种小鼠又称为半克隆小鼠。虽然成功获取了可用于基因筛选的半克隆小鼠，但由于其存活率低而极大地阻碍了haESCs在动物工程中的广泛应用[20]。研究发现，印记基因可能是阻碍半克隆小鼠存活的“元凶”，在雄性印记中，H19-甲基化差异区域(DMR)和IG-DMR是两个特殊且重要的区域，两者父源等位基因处于甲基化状态，母源等位基因则相反，因此这两个区域称为DMR，其异常甲基化会影响小鼠胚胎的正常发育[21]。早期有学者证实了H19-DMR和IG-DMR的敲除可使孤雌小鼠出生率得到有效升高，进一步研究发现，在异常的半克隆小鼠中出现H19-DMR区域的甲基化异常擦除，极有可能是获得半克隆小鼠较为困难的关键因素之一[7，22-24]。

HaESCs的另一重要特征就是自发二倍化。在体外培养的过程中，一部分单倍体细胞会成为二倍体细胞，这对于该细胞系的维持极为不利，该问题是应用haESCs过程中亟待解决的一大难点。防止二倍化的关键在于了解其机制，目前的研究结果表明，细胞周期异常，而非单倍体细胞之间的融合是自发二倍化的“罪魁祸首”。正常二倍体细胞的有丝分裂过程可分为间期和分裂期(M期)，间期又分为G1期(合成RNA与蛋白质)、S期(核内DNA合成使DNA加倍)和G2期(细胞进一步生长并合成蛋白)。然而，一些单倍体细胞在分裂期时出现异常，跳过了M期并再次进入G1/S期，因此细胞中DNA含量变为原来的两倍[25]。Takahashi等[26]课题组发现：在培养基中加入Wee1激酶抑制剂，可加快haESCs由G2期向M期的转变并防止其进入额外的G1/S期，该方法可有效增加haESCs的体外维持时长。还有研究者发现，在2i培养基中联合添加PD 166285(Wee1激酶抑制剂)和RDF(R：Repsox，TGF-β途径抑制剂；D：DMH1，BMP4途径抑制剂；F：Forskolin，腺苷酸环化酶激活剂)，可加速haESCs由S/G2期向M期的转变，进而将它的单倍体性维持时间增加至5周以上[27]。这些发现均证实单倍体细胞的异常有丝分裂机制会导致自发性二倍体化。目前，为了获得更加稳定的单倍体细胞系，单倍体细胞和二倍体细胞之间有丝分裂的详细差异以及二倍体化的分子机制仍有待揭示。

二、haESCs在基因功能研究中的应用

1. haESCs与基因筛选：通常情况下，在二倍体胚胎干细胞中很难获得纯合突变，杂合基因型对同源等位基因的表型可能没有影响，因此哺乳动物的二倍体基因组阻碍了对隐性基因功能的探究。目前，通过基因编辑技术获得等位基因纯合突变难度较大，这也阻碍了纯合基因敲除文库的产生。使用haESCs可以克服这个障碍，由于单倍体细胞只携带一套染色体，它们在突变时可表现出相应的表型，使得haESCs在功能基因组学研究以及遗传筛选方面存在广泛的应用。利用haESCs可在体外无限增殖的特性，通过基因诱捕建立全基因组的突变库，这一发展为基因研究提供了一种快速而简单的方法。通常，研究人员利用酵母自然状态下为单倍体的特性，来进行全基因组范围内的突变筛选[1]，但由于种属特异性，这种方法无法应用于哺乳动物。目前，随着获取haESCs难度的大幅降低，全基因组筛选已广泛应用于哺乳动物，以阐明不同生物学过程中各种基因的功能，极大地促进了医学和药理学研究发展。

传统的遗传学筛选有“正向遗传学”(forward genetics)和“反向遗传学”(reverse genetics)两种方式。一般来说，正向遗传筛选是通过等位基因突变获得功能丧失的表型，进而研究等位基因的功能，即从表型到基因。反向遗传筛选则是通过某个特定的基因或蛋白质的改变追踪表型的变化，是从基因到表型。haESCs可通过基因工程广泛应用于正向遗传筛选，基因组工程可通过转座子介导的插入或核酸介导的靶向修饰技术产生突变文库，这些技术包括piggyBac转座子、CRISPR/Cas9基因编辑技术和TALENS等，进行基因编辑后的haESCs通过筛选和验证，可获得特定的突变细胞。迄今为止，通过对单倍体细胞系的基因筛选，研究者们在基因功能和临床疾病研究方面取得了一定进展，例如：2019年，Bai等[28]建立了一种体内遗传筛选策略，将ICAHCI和CRISPR/Cas9文库结合用于鉴定参与骨发育的基因。该课题组使用携带组成型表达的Cas9和小向导RNA(sgRNA)文库的DKO-AG-haESCs(H19-DMR和IG-DMRs双敲孤雄单倍体)生成突变小鼠，获得携带了69个候选基因的半克隆小鼠幼崽，并验证了ICAHCI技术和CRISPR/Cas9文库结合可有效获取突变半克隆小鼠。该研究通过筛选骨骼发育过程中的关键基因，发现了4个骨发育相关基因：Zic1、Clec11a、Rln1和Irx5，为haESCs应用于功能性遗传筛选开辟了新的渠道。同年，该课题组通过向卵母细胞注射含有强直性肌营养不良征I型相关突变基因的haESCs生成杂合小鼠，并成功模拟了强直性肌营养不良征I型的相关症状，这一发现不仅有利于阐明疾病发病机制，更证实了haESCs可用于建立疾病相关动物模型，拓展了其应用前景[29]。

综上所述，利用haESCs进行遗传筛选，将促进发育生物学和再生医学在基础与临床研究领域的发展，对物种进化、谱系分化、信号通路、生物分子的相互作用和癌症领域的研究有重要的价值。

2. haESCs与X染色体失活：haESCs的另一潜在应用是研究X染色体失活(XCI)的相关机制在哺乳动物的XY性别决定机制中存在的基因剂量补偿效应，该效应使得性连锁基因在两种性别中有相等或近乎相等的有效剂量，而XCI则是与该效应密切相关的一个表观遗传修饰和发育过程。在XCI机制作用下，二倍体雌性体细胞中的一条X染色体处于转录激活状态(Xa)，另一条通过表观遗传机制处于沉默状态(Xi)，而二倍体雌性胚胎干细胞可表现出不同的XCI状态，如XaXa或是更为常见的XaXi[30]。XCI与长链非编码RNA Xist表达密切相关[31]，Xist可使一条X染色体随机失活。Monfort等[32]使用诱导Xist过表达系统成功筛选出XCI过程中的关键调控因子——RNA结合蛋白SPEN，证实了SPEN是Xist发挥基因抑制作用所必需的。SPEN的鉴定为进一步研究Xist的基因沉默途径开辟了道路，显示了haESCs在研究表观遗传途径的遗传筛选中的作用。Li等[33]课题组利用小鼠和大鼠的haESCs成功构建出了小鼠-大鼠杂交异源二倍体胚胎干细胞(AdESCs)，这些AdESCs的异源二倍体基因组相对稳定，具有二倍体细胞的普遍特性。此外，他们还发现了一个有趣的现象：几乎所有被测序的X连锁基因转录本都映射到了大鼠的X染色体上，然而介导沉默的Xist基因的转录本，被单独定位到小鼠X染色体上，这些结果表明，小鼠X染色体在异源二倍体细胞中处于失活状态。他们还系统地分析了大量RNA-seq数据，在异源二倍体体细胞中发现了146个未知的小鼠基因，这些基因可能与X染色体失活逃逸有关。以上研究成果证实了单倍体的衍生物AdESCs是研究X染色体失活相关机制并筛选XCI失活逃逸基因的强力工具。

3. haESCs与CRISPR/Cas9：haESCs作为一种强大的研究基因功能的工具，可以将基因功能研究从细胞水平提升至个体水平，即通过基因编辑技术与ICAHCI技术建立半克隆小鼠的基因突变文库，而CRISPR/Cas9技术作为其中具有代表性的技术，大大降低了细胞水平上基因编辑的难度，使得haESCs与基因编辑技术结合应用于基因功能研究成为可能。CRISPR/Cas9是一种由RNA指导Cas9核酸内切酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，在该系统中，Cas9核酸内切酶可通过容易进行修饰的引导RNA(guide RNA)靶向结合并切割特定DNA序列，并通过这种方式高效特异地进行基因操作[34]。通常，基于同源重组的基因组编辑技术在小鼠胚胎干细胞的遗传修饰中有着广泛的应用[35]，但是这种方式存在F0代基因型不稳定、嵌合体占较大比例、文库制备费时费力以及在制备多个基因编辑的模型上效率低下等问题，尤其是在建立多个基因编辑的动物疾病模型时尤为明显，因为获取多个特定基因的突变成功率极低，而且在妊娠期长、性成熟时间长以及单胎生育的大型动物身上难以实行，使用haESCs则可以很大程度上解决这些问题。首先，haESCs可无限增殖并分化为三胚层，因此可获得大量的样本进行CRISPR-Cas9文库导入和筛选，这确保了获得的半克隆动物模型携带了特定的遗传修饰，很大程度上避免了获得嵌合体F0代的问题，有效缩短了获取模型动物的周期。除此之外，孤雄单倍体胚胎干细胞有精子的特性，可使卵母细胞受精，对其进行细胞水平的遗传修饰通过遗传给后代完成了从细胞到个体水平的转变；其次，haESCs作为“中介”，可实现一步转化为个体文库，通过细胞水平筛选避免了个体水平的筛选，极大节约了试验成本及时间。

2018年，Li等[36]课题组将CRISPR/Cas9介导的单碱基编辑系统(BE3)与haESCs介导的半克隆技术结合，在个体水平上进行了Dnd1氨基酸功能位点的遗传筛选。Dnd1基因是影响小鼠原始生殖细胞(PGCs)发育的重要基因，他们发现将携带BE3的haESCs注入卵子可以产生纯合突变的半克隆小鼠，而向haESCs中导入Dnd1基因的靶向sgRNA慢病毒文库可以在半克隆小鼠诱导单碱基突变，最终发现了E59K、V60M、P76L和G82R对DND1蛋白质稳定性具有重要作用。该体系拓展了haESCs在研究蛋白质结构与功能方面的应用，使得预测疾病相关基因的致病位点成为可能。除此之外，CRISPR/Cas9系统以其独特的优势促进了全基因组敲除haESCs文库的产生，两者之间的“强强联手”将会进一步促进遗传学、生物学、医学等各个领域的发展。

4. haESCs与印记基因研究：人类二倍体基因组包含23条母源染色体和23条父源染色体，正常情况下，父源与母源等位基因均有表达。然而，1984年McGrath等[37]和Surani等[38]等通过尝试建立孤雌(双母本来源)和孤雄(双父本来源)胚胎证实了在哺乳动物中，亲代基因组功能并不均等，且亲本双方的基因组都是胚胎发育所必需的，而这种模式便是通过基因印记的方式实现的。基因印记本质上是一种差异性表观遗传机制，在这种表观遗传机制中，亲本的等位基因出现差异性表达进而影响表型表达[39]。长期以来，研究者常用同源敲除重组法作为确定印迹基因体内功能的标准方法，即通过敲除印记产生相应的模式动物揭示印记基因的效应。这种策略耗费大量时间与资源，严重阻碍了印记基因功能研究的发展。相比之下，若能够通过haESCs代替卵母细胞或精子的基因组构建动物模型，可节省大量人力、物力与时间，极大地方便了在体内研究印记基因功能和调控机制。比如，结合CRISPR/Cas9技术，在体外对haESCs进行修饰生成具有特定遗传修饰的小鼠模型，可成为研究印记基因功能的一种全新工具。目前，对于该细胞系是否能够代替卵母细胞或精子基因组高效获得足月发育的子代尚未定论，但在探索印记基因功能和调控机制方面，haESCs仍不失为一种潜在的高效便捷的研究工具。

5. haESCs与单性生殖：单性生殖包括孤雌生殖与孤雄生殖。孤雌生殖是指卵子在不受精的情况下通过自身DNA复制而发育成一个新个体，在自然界中较为常见，如蜥蜴、蛙和鱼类中均存在孤雌生殖现象。与之对应，孤雄生殖只存在于极个别低等动物中，高等哺乳动物中目前还未发现孤雄生殖现象，这是因为印记基因阻碍了单一亲本基因组胚胎的正常发育，它的存在为冲破性别壁垒增添了一道难以跨越的“鸿沟”。跨越“鸿沟”的第1步始于2004年，日本科学家Kono等[22]利用缺失H19印记区的未成熟卵母细胞首次获得了活的孤雌小鼠，首次实现了哺乳动物孤雌生殖，这一重大突破验证了基因印记正是小鼠单性生殖的阻碍，加深了人们对于印记基因的理解。3年后，Kawahara等[23]通过改进这一方法，即删去H19-DMR和IG-DMR两个印记区域提高了孤雌小鼠的出生率。之后，随着各种生物的单倍体胚胎干细胞系的建立，人们逐渐发现了haESCs作为配子替代物生成单性生殖动物的“妙用”，虽然孤雌小鼠的获取已然不是困难，但孤雄小鼠的难关一直未被攻克。直到2018年，Li等[40]团队率先取得进展，为获取活体孤雄小鼠，他们敲除了包含Gnas免疫印迹区在内的7个印记区，并通过四倍体补偿的方式从477个胚胎中获取了12只孤雄小鼠，这是世界上第1例拥有两个父源基因组的孤雄小鼠，证实了高等哺乳动物中实现孤雄生殖的可行性。虽然12只小鼠中有10只存活不到两天，剩余2只也未成年，但是该团队以haESCs作为研究工具，阐述了哺乳动物跨越同性生殖障碍的必要因素，说明了以haESCs为配体替代物构建胚胎体系的方法可作为“跳板”研究胚胎发育调控机制，进一步延伸了haESCs应用的深度和广度。

三、结论与展望

在人类疾病与细胞功能研究进展不断深化的背景下，haESCs的研究已达到一定的水准。虽然其细胞系的建立、维持及将细胞系转化为实际应用的过程中尚存在许多问题，但haESCs具有的多能性以及在各种临床与基础医学中的适用性都证明了其具备重要的应用价值，目前研究者对于haESCs的性质和获取方法已具备了相当程度的认知，未来的研究应着眼于如何高效保存haESCs并将其应用于各种领域上。总而言之，haESCs在未来的一段时间内仍会是干细胞研究的重点之一。