高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱法鉴别白酒中羧酸

廖勤俭，王小琴，周韩玲，安明哲，李杨华，郭 艳，宋廷富，罗 珠

（宜宾五粮液股份有限公司，四川宜宾 644007）

羧酸(Carboxylic Acid) 是白酒中常见的，也是最重要的一类有机酸。白酒酿造过程中产酸途径很多，很多有机物都能通过化学反应或微生物代谢生成有机酸，低级羧酸也可以逐步合成高级的羧酸，醇、醛等也可以氧化成羧酸。羧酸在白酒酒味协调中起着举足轻重的作用，特别是高级脂肪酸对白酒后味的影响，同时羧酸也是白酒重要呈香组分羧酸酯的重要前体物质。

白酒生产中关注较多的是酒体或酿酒过程中乳酸、乙酸、丁酸、己酸的比例及变化关系[1-2]，这与此前研究中主要以气相色谱（GC）[3]或气相色谱质谱联用（GC-MS）[4]技术为主有关，高沸点的羧酸化合物难以气化，即使使用酯化衍生处理后，有些羧酸也无法解析。采用高效液相色谱法[5-6]，离子色谱法[7-8]进行有机酸的检测，需要标准对照品对目标物进行定性定量分析，无法检测白酒中未知的羧酸成分。夏季气温高，白酒生产企业普遍存在糟醅酸度高的问题，出窖糟醅中的羧酸随着上甑蒸馏过程进入酒体。为明确白酒中各羧酸对酒糟酸度、酒体酸度的贡献，笔者利用高分辨的高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用检测技术，根据羧酸化合物在目标离子扫描模式下的裂解规律，无需对照品，较全面的分析了白酒中存在的有机羧酸化合物，特别是白酒中沸点较高的难挥发性羧酸。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇（MERCK,LC-MS级），超纯水，白酒样品（实验室自备）。

1.2 仪器与设备

美国Agilent公司1290系列高效液相色谱仪；(HPLC)-6520B系列质谱检测器（Q-TOF）；Agilent MassHunter数据采集工作软件、定性分析软件；Milli-Q超纯水机（美国Mimpore公司）。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18(2.1×100 mm 1.8-micron) ；柱温：30 ℃；流速：0.2 mL/min；进样量：2 μL；流动相为甲醇B（液质级）和超纯水A（含0.1 g/L甲酸）；梯度洗脱条件：0～15 min：5%～100 % B，15.1～23 min：100 % B，23.1～25 min：5 %B，25 min：stop。

1.3.2 质谱条件

采用电喷雾电离源(DESI)；负离子模式扫描；离子源温度为325 ℃；干燥气流量为10 L/min；雾化器压力为35 psig；碰撞电压为60 V。

1.3.3 样品前处理

白酒样品10 mL，40 ℃真空浓缩，甲醇定容至2 mL，膜过滤后作为待测样品。

2 结果与分析

2.1 羟基羧酸的质谱裂解规律

羟基羧酸的碳链上带有一个-OH，即是羟基位于α位(与羧基碳原子直接相连的碳原子)，这一类羟基酸的-COOH相互影响较为活泼，还原性强，在一定的碰撞能量下，羧基碳原子与羟基碳原子之间断裂，丢失-HCOOH，以α-羟基庚酸为例，其在15 V碰撞能量下的质谱图如图1所示。同时以白酒中已知的丁二酸二乙酯为例，其在流动相中以-H替换一端的-C2H5，全扫描模式下呈现出的M/Z为145.0501，与α-羟基庚酸的M/Z相近，以此为母离子的二级质谱图详见图2，其碎片离子为99.0088也与α-羟基庚酸的碎片离子99.0818相近，高分辨率的检测器仍能有效的辨别。

图1 α-羟基庚酸二级质谱图

图2 丁二酸二乙酯二级质谱图

2.2 二羧酸的质谱裂解规律

二羧酸的碳链上带有两个-COOH，通常处于分子末端，在一定的碰撞能量下，依次丢失-H2O和-COOH，以丙二酸和壬二酸为例，丙二酸在5 V碰撞能量下的质谱图见图3，壬二酸在15 V碰撞能量下的质谱图如图4所示。

图3 丙二酸二级质谱图

图4 壬二酸二级质谱图

2.3 芳香羧酸及杂环羧酸的质谱裂解规律

芳香羧酸，其羧基或位于芳香环上，如苯甲酸；或位于苯环上的碳支链末端，如苯乙酸。两种情况下的羧酸质谱裂解规律是一致的。在一定的碰撞能量下，丢失-COOH，以4-甲基苯甲酸为例，其在2 V碰撞能量下的质谱图如图5所示。杂环羧酸质谱裂解规律与芳香羧酸一致，丢失-COOH，以呋喃甲酸为例，其在5 V碰撞能量下的质谱图如图6所示。

图5 甲基苯甲酸二级质谱图

图6 呋喃甲酸二级质谱图

2.4 一元羧酸的质谱裂解规律

此处的一元羧酸为直链烷烃或支链烷烃末端接一羧基（COOH），以白酒中常见的正己酸、异己酸为例，其在不同碰撞能量下具有结构稳定性。正己酸和异己酸在20 V碰撞能量下的质谱图见图7、图8。

2.5 白酒中羧酸的质谱分析结果

白酒样品，按1.3.3进行样品前处理后，进LCQTOF进行检测分析。以2.1、2.2、2.3、2.4的各类羧酸质谱断裂规律，根据白酒样品一级质谱扫描结果确定的分子式，目标离子扫描模式下质谱的碎片离子，定性解析样品中的羧酸类化合物。样品中的各化合物解析结果详见表1。

图7 正己酸二级质谱图

图8 异己酸二级质谱图

3 结论

本研究采用高效液相色谱四级杆飞行时间质谱联用技术，利用羧酸类化合物在目标离子扫描模式下的裂解规律，解析出白酒样品中的46种羧酸成分，其中包括5个α-羟基羧酸，3个杂环羧酸，4个芳香羧酸，3个二羧酸，5个酚酸，26个一元羧酸。

乙酸和丙酸属于白酒中的常见羧酸，该方法侧重于解析白酒中的未知高沸点羧酸。由表1可以看出，白酒中除去熟知的乙酸、丁酸、己酸、乳酸（α-羟基丙酸）外，还有一定含量的α-羟基丁酸、α-羟基戊酸、α-羟基己酸、α-羟基庚酸。白酒酿造及白酒酒体中α-羟基戊酸和α-羟基己酸的存在及变化情况，鲜有研究报道，其在酒体中形成的酯类化合物更是鲜见的。另外，白酒中也存在杂环羧酸和芳香羧酸，如检出的呋喃甲酸、3-氧环丁羧酸、四氢-2-呋喃羧酸、苯甲酸、苯丙酸、甲基苯甲酸、羟基苯丙酸；白酒中还存在具有抗氧化活性的酚酸，如羟基苯甲酸、阿魏酸、香草酸、丁香酸、原儿茶酸；该方法能解析出白酒中研究较多的一元羧酸，从丁酸到硬脂酸，同时还发现不常见的不饱和烯酸，十四烷烯酸、十五烷烯酸、十六烷烯酸、十七烷烯酸、十九烷烯酸和二十烷烯酸。

表1 化合物的质荷比、分子式、碰撞能量、碎片离子、断裂方式和名称

研究过程中发现，白酒中的二羧酸和α-羟基羧酸很容易与醇酯化反应生成相应的酯。如丁二酸在白酒中形成的丁二酸乙酯、丁二酸二乙酯。丁二酸乙酯的分子式C6H10O4，很容易误认为是己二酸，通过目标离子扫描进行二级质谱碎片离子解析发现，其碎片特征离子为99.0048，丢失了C2H6O，所以该化合物应是丁二酸乙酯，或是在流动相中-H替换一端的-C2H5的丁二酸二乙酯。另有全扫描模式下分子式为C7H12O4的化合物，也易认为是庚二酸，而其碎片离子为乳酸和丁酸的特征离子89.0244和87.0457，丢失的是C4H7O2或C3H5O2，说明该化合物是乳酸与丁酸形成的酯。由此，该方法能有效的分辨白酒中相同分子式下的酸酯成分，解析白酒中的羧酸成分。