1,2-己二醇在中药抗瘙痒外用乳液中的抑菌效能研究*

田雅娟，李钦青，杜 娟，张晓燕，贺文彬

(山西中医药大学，山西 太原 030024)

化妆品在存储和使用过程中，极易受到微生物的污染而导致腐败。为了使其在保质期及使用过程中不被污染，需要添加一定量具有抑菌功效的成分[1～2]。由于化妆品的成分复杂，包括油性原料、粉质原料和水溶性聚合物等，其中干扰防腐剂作用效果的因素比较广泛，因此防腐剂种类的选择或复配是化妆品研制过程中的一个重要环节[3～4]。《化妆品安全技术规范》[5](2015版)对于51种允许添加的防腐剂的使用剂量都做了明确限制，以此来预防潜在风险。因此如何减少防腐剂的用量，降低致敏性的同时保证产品质量，平衡防腐剂用量和其抑菌效果显得尤为重要[6～7]。近年来，国内外关于市售化妆品微生物污染状况调查研究表明，微生物指标不合格的产品仍占有一定比例[8～9]。为了保障化妆品的品质安全，添加防腐剂成为抑制微生物污染的主要手段，防腐剂添加量过少，易诱导细菌产生耐药性，添加量过多，会对人体安全产生影响，因此防腐方案选择以及防腐效果评价必不可少。常被用作保湿剂及溶剂的1,2-己二醇目前在个人护理品工业中也已经得到广泛的应用，其保湿性和安全性已得到验证，同时显示出了一定的抗微生物效果[10]。笔者以1,2-己二醇为研究对象，通过微生物挑战性试验，测试1,2-己二醇及其与1,2-戊二醇、1，3丁二醇的复配方案在乳剂型样品中单独及复配使用的防腐效果，并与杰马BP进行比较，以期为开发具有高效防腐效果的无防腐剂化妆品提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

大肠杆菌ATCC 8739(广东环凯微生物科技有限公司)；绿脓杆菌ATCC 9027(广东环凯微生物科技有限公司)；金黄色葡萄球菌ATCC 6538(广东环凯微生物科技有限公司)；白色念珠菌ATCC 10231(广东环凯微生物科技有限公司)；黑曲霉菌ATCC 16404(广东环凯微生物科技有限公司)；人参花(山西中医药大学附属医院中药房)；紫草(山西中医药大学附属医院中药房)；当归(山西中医药大学附属医院中药房)；虎杖(山西中医药大学附属医院中药房)；地榆(山西中医药大学附属医院中药房)；丁二醇(OXEA公司)；甘油(德国EMERY公司)；甜菜碱(美国安格公司)；环聚二甲基硅氧烷(美国DOWCORNING公司)；鲸蜡硬脂醇(法国SEPPIC公司)；透明质酸(山东福瑞达生物医药有限公司)；霍霍巴酯类(美国FLORATECH公司)；胶原蛋白(法国罗赛洛公司)；生化培养箱(上海一恒科技仪器有限公司)；1,2-戊二醇(广州广曼生物科技有限公司)；1,2-己二醇(广州广曼生物科技有限公司)；杰马BP(北京桑普生物化学技术有限公司)；1，3-丁二醇(山东西亚化学股份有限公司)；生化培养箱(上海一恒科技仪器有限公司)；霉菌培养箱(上海博讯实业有限公司)；恒温恒湿箱(施都凯仪器设备上海有限公司)。

1.2 试验方法

预先配制质量分数为1 % 的卡波姆水溶液，将油相和水相分别升温至85 ℃，搅拌至溶解均匀，抽油乳化10 min，降温至55 ℃加入预配制溶液，再次降温至40 ℃加入氨甲基丙醇中和，搅拌至混合均匀。实验用乳液基质为本实验室自制的样品，生产过程经过严格的无菌控制，基质成分及含量如表1所示。

表1 乳液配方

1.2.1 实验用菌液的配制

各取一株标准菌株分别接种到普通斜面培养基上，细菌所需温度(36±1)℃，恒温培养48 h，霉菌(28±1)℃，恒温培养5 d，用少量的生理盐水分别将斜面上的菌苔洗出，充分摇匀，经适当稀释分别制成109cfu/mL混合细菌悬液和107cfu/mL混合霉菌悬液，置于冰箱4 ℃冷藏备用。进行微生物挑战试验前，测定乳液基质中细菌、霉菌含量，确保其数值小于10 cfu/g或10 cfu/mL[11]。

1.2.2 微生物挑战性试验

实验参考美国药典(USP)[12]化妆品、盥洗用品与香料协会(CTFA)[13]以及中国药典(2015年版三部)的微生物挑战性试验方法，即在乳剂样品中添加一定量的微生物菌悬液，每间隔一段时间用平板计数法检测微生物的存活情况，观察28 d后，判断防腐剂的防腐效果。

测试不同防腐方案的抑菌效果，四种方案分别为：方案一：1,2-戊二醇1 %+1,2-己二醇2 %；方案二：杰马BP 0.3 %；方案三：1,2-己二醇3 %；方案四：1,2-戊二醇0.5 %+1,2-己二醇1.5 %+1，3-丁二醇5 %。

称取各受试样品20 g于灭菌50 mL离心管内，分别添加 0.2 mL 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、黑曲霉菌和白色念珠菌的菌悬液，使受检样品取得最终含菌量：细菌3.0×106～3.0×107cfu/g或cfu/mL、霉菌1.0×104～1.0×105cfu/g或cfu/mL，充分混匀，将样品置于(28±1)℃条件下，于接菌后 0 d、7 d、14 d、21 d、28 d用平板计数法检测微生物的生长情况。

实验结果判定标准如下：按照化妆品、盥洗用品与香料协会(CTFA)标准要求，当细菌在7 d之内至少减少99.9 %，并且测试7 d～28 d没有增加;霉菌在7 d之内应该至少减少90 %，并且测试7 d～28 d没有增加判定为挑战通过。

2 结 果

四种不同的防腐方案抑菌效果如表2所示，细菌在7 d之内下降率均大于99.9 %，并且测试7 d～28 d没有增加；霉菌在7 d 之内下降率均大于90 %，并且测试7 d～28 d没有增加。四种防腐方案均可通过微生物挑战性试验，第7天菌数的下降率以及28 d内菌数的变化趋势如表3所示。

方案(1)中，黑曲霉菌第7天菌落的数量由9.1×105cfu/mL下降至1.4×103cfu/mL，第14天为3.0×102cfu/mL，第21天下降至小于10 cfu/mL，7 d下降率为99.8 %，大于90 %，在7 d～28 d 呈现连续下降的趋势；绿脓杆菌第7天菌落的数量由1.1×107cfu/mL下降至1.2×103cfu/mL，第14天下降至小于10 cfu/mL，7 d下降率远远大于90 %，在7 d～28 d呈现连续下降的趋势；混合菌第7天菌落的数量由5.6×106cfu/mL下降至9.0×102cfu/mL，第14天下降至20 cfu/mL，第21天下降至小于10 cfu/mL，7 d下降率远远大于90 %，在7 d～28 d呈现连续下降的趋势。

方案(2)中，黑曲霉菌第7天菌落的数量由9.1×105cfu/mL下降至50 cfu/mL，第14天下降至小于10 cfu/mL，7 d下降率为99.8 %，大于90 %，在7 d～28 d呈现连续下降的趋势；绿脓杆菌第7天菌落的数量由1.1×107cfu/mL下降至小于10 cfu/mL，7 d时下降率远远大于90 %，在7 d～28 d呈现连续下降的趋势；混合菌第7天菌落的数量由5.6×106cfu/mL下降至6.0×102cfu/mL，第14天下降至小于10 cfu/mL，7 d下降率远远大于90 %，在7 d～28 d呈现连续下降的趋势。

方案(3)中，黑曲霉菌第7天菌落的数量由9.1×105cfu/mL下降至4.0×102cfu/mL，第14天下降至小于10 cfu/mL，7 d下降率为99.8 %，大于90 %，在7 d～28 d呈现连续下降的趋势；绿脓杆菌第7天菌落的数量由1.1×107cfu/mL下降至小于10 cfu/mL，7 d时下降率远远大于90 %，在7 d～28 d呈现连续下降的趋势；混合菌第7天菌落的数量由5.6×106cfu/mL下降至小于10 cfu/mL，7 d下降率远远大于90 %，在7 d～28 d呈现连续下降的趋势。

方案(4)中，黑曲霉菌第7天菌落的数量由9.1×105cfu/mL下降至2.4×103cfu/mL，第14天为2.0×102cfu/mL，第21天下降至小于10 cfu/mL，7 d下降率为99.8 %，大于90 %，在7 d～28 d 呈现连续下降的趋势；绿脓杆菌第7天菌落的数量由1.1×107cfu/mL下降至小于10 cfu/mL，7 d下降率远远大于90 %，在7 d～28 d呈现连续下降的趋势；混合菌第7天菌落的数量由 5.6×106cfu/mL下降至5.0×102cfu/mL，第14天下降至小于10 cfu/mL，7 d下降率远远大于90 %，在7 d～28 d呈现连续下降的趋势。

实验结果显示:四种方案中，第7天白色念珠菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌菌落的数量分别由8.0×105cfu/mL、7.3×106cfu/mL及6.8×106cfu/mL下降至小于10 cfu/mL，第7天时霉菌数量降低90 %，细菌数量降低99.9 %，并且28 d内菌数持续下降。

表2 微生物挑战实验

表3 微生物挑战测试结果

四种方案第7天黑曲霉菌菌落数量分别为1.4×103cfu/mL、50 cfu/mL、4.0×102cfu/mL、2.4×103cfu/mL，第14天黑曲霉菌菌落数量分别为3.0×102cfu/mL、小于10 cfu/mL、小于10 cfu/mL、2×102cfu/mL，抑菌效果最强的是杰马BP 0.3 %和1,2-己二醇3 %，其次是1,2-戊二醇0.5 %+1,2-己二醇1.5 %+1，3-丁二醇5 %，再次是1,2-戊二醇1 %+1,2-己二醇2 %。如图1所示。

图1 微生物挑战性试验结果-黑曲霉菌

四种方案第7天混合菌落数量分别为9.0×102cfu/mL、6.0×102cfu/mL、10 cfu/mL、5.0×102cfu/mL，第14天混合菌落数量分别为20 cfu/mL、小于10 cfu/mL、10 cfu/mL、小于10 cfu/mL。抑菌效果由强到弱分别是1,2-己二醇3 %、1,2-戊二醇0.5 %+1,2-己二醇1.5 %+1，3-丁二醇5 %、杰马BP 0.3 %、1,2-戊二醇1 %+1,2-己二醇2 %。如图2所示。

实验结果显示：分别添加了1,2-戊二醇1 %+1,2-己二醇2 %、杰马BP 0.3 %、1,2-己二醇(3 %)、1,2-己二醇(1.5 %)+1,2-戊二醇(0.5 %)+1，3丁二醇(5 %)的样品中，在第7天时霉菌数量降低90 %，细菌数量降低99.9 %，并且28 d内菌数持续下降。四种防腐方案均通过了微生物挑战性试验。

3 结 论

化妆品防腐剂的使用目的在于杀灭微生物或抑制其生长，维持化妆品的保存及使用期限，高效安全的防腐体系是稳定化妆品配方的关键之一。1,2-己二醇无色无味，以往的研究表明，其可以起到提高皮肤水分含量、增加其他物质溶解度的作用，适用于绝大多数的化妆品体系当中，不会受到极端的温度及pH值的影响，液体稳定性强，具有一定的抑菌效果[11]。1,2-戊二醇温和不刺激，适用于敏感性皮肤、婴幼儿等柔嫩皮肤及衰老干燥皮肤的护理。其在大范围pH值下稳定，与多数化妆品成分相容，一般作为保湿剂、抗菌剂和增溶剂使用。1，3丁二醇在化妆品中常作保湿剂和溶剂使用，也具有一定的抑菌作用。目前烷基二元醇在化妆品中已得到了广泛应用，具有优异的保湿性和安全性，同时也有研究表明其具有一定的抗微生物性能。本研究通过微生物挑战性试验，验证了1,2-己二醇以及其与1,2-戊二醇、1，3-丁二醇的复配防腐方案在乳剂型样品中的抑菌效果，四种防腐方案均顺利通过了微生物挑战性试验，在第7天对于细菌的抑制率都达到了99.9 %，对于霉菌的抑制率达到了90 %。

1,2-己二醇、1,2-戊二醇及1，3-丁二醇广泛被作为保湿剂和增溶剂使用，然而其在使用及研究过程中显示出了很好的防腐效果。不同微生物对不同抗菌剂的敏感性差异较大，因此复配方案更能够满足需求，将1,2-己二醇、1，3-丁二醇和1,2-戊二醇复配代替传统防腐剂的报道并不多见，笔者以1,2-己二醇为研究对象，通过测试1,2-己二醇在乳剂型基质中单独及复配使用的防腐效果，提出复配防腐体系方案，以期为开发高效的无防腐剂特殊用途化妆品提供依据。