桑芪首乌片对局灶性脑缺血再灌注大鼠BDNF及其受体TrkB表达的影响

顾力华， 陈奇刚， 陆家龙， 魏丹霞， 杨仁华， 陈鹏， 司林阁

（1.昆明市中医医院，云南昆明 650559；2.昆明医科大学，云南昆明 650500；3.云南中医药大学，云南昆明 650500）

脑梗死是最常见的脑血管疾病之一，存活患者有70%～80%致残[1]。积极有效地促进患者神经功能的恢复是治疗本病的重点和难点。国家级名中医陆家龙主任医师以数十年的临证经验方桑芪首乌方在对脑梗死偏瘫患者的临床治疗观察中显示其有较好疗效[2]。本研究应用由桑芪首乌方制备成的桑芪首乌片，观察其对大鼠脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）后脑缺血再灌注损伤时脑神经源性神经生长因子（brainderived neurotrophic factor，BDNF）及其酪氨酸激酶受体B（tyrosine kinase receptor B，TrkB）表达的影响，以探讨该方对脑梗死大鼠脑神经的保护作用及机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级SD雄性大鼠70只，体质量（200±20）g，购自昆明医科大学实验动物学部，许可证号：SYXK（滇）K2015-0002。动物饲养室温度（22±2）℃，相对湿度50%～65%，自由光照。

1.2 药物 桑芪首乌片，由桑寄生、首乌、黄芪等12味中药组成，由昆明市中医医院制剂科提供。天麻钩藤颗粒（成都九芝堂金鼎药业有限公司，20 mg/片，批号：20151213）；尼莫地平片（山东新华制药股份有限公司，20 mg/片，批号：20151121）。

1.3 主要试剂与仪器 BDNF、TrkB即用型SABC免疫组织化学染色试剂盒[赛默飞尔（Invitrogen）中国公司]。电热恒温培养箱（中国上海精宏实验设备有限公司）。

1.4 局灶性脑缺血再灌注大鼠模型制备 SD大鼠经适应性喂养1周后开始造模，实验前动物禁食12 h，自由饮水。参照相关文献[3-7]，采用改良线栓法制备局灶性脑缺血再灌注大鼠模型。SD大鼠用100 g/L水合氯醛按0.35 mL/100 g（体质量）腹腔注射麻醉，仰卧位固定，颈部手术区剔毛。沿颈中线切口，分离左侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，结扎颈总动脉和颈外动脉。用微动脉夹暂时夹闭颈内动脉，然后近心端结扎颈总动脉和颈外动脉。在颈总动脉距其与颈内动脉交叉4 mm处剪45°斜口，将拴线插入到颈内动脉，从血管分叉处计算，插入长度18 mm时要放松血管保持原来状态。再轻轻往前插，当稍有阻力增大，即停止插入。颈内动脉打结，防止线栓滑脱。缝合各层组织，使线一端露出皮肤约0.5 cm。缺血2 h，拔出线栓，形成再灌注损伤。假手术对照组大鼠仅沿颈中线切口，不分离血管和结扎。模型制备成功标准：在大鼠清醒后用Bederson评分分级法观察其神经行为学变化。评分≥2分说明造模成功，则纳入本实验。Bederson评分观察内容包括提鼠尾、前肢屈曲、移动时阻力、肌张力、转圈等，每项神经损伤症状分为0～4个功能等级，满分为11分，分数越高，表示动物神经行为障碍越严重[8]。

1.5 分组与给药 将造模成功后的大鼠按随机数字表随机分为6组，每组10只，即模型对照组，尼莫地平片对照组，天麻钩藤颗粒对照组，桑芪首乌片高、中、低剂量组，另加上假手术对照组（10只），共计7组。造模后24 h内开始第1次给药。桑芪首乌片高、中、低剂量组给予桑芪首乌片（生药剂量分别为2.8、1.4、0.7 g/kg，相当于成人等效剂量20、10、5倍）双蒸水溶液灌胃；尼莫地平片对照组给予尼莫地平片（剂量为7.7 mg/kg）双蒸水溶液灌胃；天麻钩藤颗粒对照组给予天麻钩藤颗粒（剂量为2.0 g/kg）双蒸水溶液灌胃；模型对照组和假手术对照组给予等体积双蒸水灌胃。容量按1.0 mL/100 g（体质量）计，每天1次，连续6周。

1.6 观察指标与方法

1.6.1 标本的取样 实验结束，即第6周后，禁食12 h，将大鼠用100 g/L水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，麻醉后迅速从后颈处断头处死，逐层分离，取出大脑，放入40 g/L多聚甲醛中，4℃保存。石蜡切片前切成2～3 mm厚的小块并在不同酒精浓度下脱水。后放入二甲苯2次，65℃浸蜡，室温冷却后切片。

1.6.2 神经行为学评分 采用Bederson评分分级法。于术后当日，术后第3、6周分别对各组大鼠进行神经行为学评分并记录结果。

1.6.3 SABC免疫组织化学法检测大鼠脑组织BDNF、TrkB表达 主要操作步骤：石蜡包埋的切片经pH7.4磷酸盐缓冲液（PBS）浸洗3次，加入过氧化氢室温孵育15 min，pH7.4 PBS浸洗2遍。加入Ultra V block试剂室温孵育5 min，pH7.4 PBS浸洗3次。加入1∶500稀释的小鼠抗人一抗抗体，4℃孵育过夜，pH7.4 PBS浸洗3次。加入生物素标记的二抗室温孵育20 min，pH7.4 PBS浸洗4次。加入链霉亲和素—过氧化物酶室温孵育20 min，pH7.4 PBS浸洗4次。DAB显色。显微镜观察并拍照。在显微镜的目镜（×200）下，每张切片选3个视野，观察阳性细胞数目。BDNF、TrkB阳性表达均显示为细胞核内呈棕黄色样染色。

1.7 统计方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。所有数据均以均数±标准差(-x±s)表示，多组比较采用单因素方差分析。方差齐时，组间两两比较采用LSD统计方法；若方差不齐时，组间两两比较采用Dunnett's T3法检验。以Ρ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠神经行为学评分比较 表1结果显示：假手术对照组大鼠在整个实验过程中均未出现神经行为异常表现，评分均为0分。动物模型复制完成后，与假手术对照组比较，模型对照组神经行为学评分明显增高（P＜0.05）；与模型对照组比较，桑芪首乌片高、中、低剂量组，天麻钩藤颗粒对照组及尼莫地平片对照组神经行为学评分无明显差别（P＞0.05）。给药3周后，与假手术对照组比较，模型对照组神经行为学评分明显增高（P＜0.05）；与模型对照组比较，桑芪首乌片高、中剂量组，天麻钩藤颗粒对照组及尼莫地平片对照组神经行为学评分明显降低（P＜0.05）。给药6周后，与假手术对照组比较，模型对照组神经行为学评分进一步增高（P＜0.05）；与模型对照组比较，桑芪首乌片高、中剂量组，天麻钩藤颗粒对照组及尼莫地平片对照组神经行为学评分明显降低（P ＜ 0.05）。

表1 各组大鼠神经行为学评分比较Table 1 Comparison of the neurobehavioral scores in various groups （-x±s，s/分）

2.2 各组大鼠脑组织BDNF和TrkB表达水平比较 图1、2，表2结果显示：与假手术组比较，模型对照组脑组织BDNF、TrkB表达阳性细胞数均增加，其中：BDNF表达阳性细胞数明显增加，差异均有统计学意义（P＜0.05），TrkB表达阳性细胞数增加，差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型对照组比较，桑芪首乌片高、中、低剂量组BDNF、TrkB表达阳性细胞数明显增加，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

图1 各组大鼠脑组织BDNF表达比较（免疫组织化学法，×200）Figure 1 Comparison of the expression of BDNF in various groups（by immunohistochemical method，×200）

图2 各组大鼠脑组织TrkB表达比较（免疫组织化学法，×200）Figure 2 Comparison of the expression of TrkB in various groups（by immunohistochemical method，×200）

表2 各组大鼠脑组织BDNF及TrkB表达的比较Table 2 Comparison of the expression of BDNF and TrkB in various groups （-x±s，n/个）

脑梗死后导致脑神经损伤的过程是一个多环节、多因素、多途径的复杂过程。神经保护剂的研发成为当前治疗脑梗死的难点。中医药在改善脑缺血再灌注损伤方面有明显的优势[9-14]。

本课题组在前期临床应用中发现桑芪首乌方对缺血性脑卒中患者的中医证候、偏瘫肢体的运动功能有明显的改善作用，其中医证候疗效总有效率为85.29%，优于对照组的66.67%，差异有统计学意义（P＜0.05）[2]。桑芪首乌方方中：制首乌，味苦、甘，性微温，归肝肾经，善补肝肾、益精血；桑寄生味苦、性平，归肝肾经，可益肝肾、强筋骨，偏走于肢体筋脉。配伍黄芪等中药以益气活血化瘀。诸药合用，肝肾得补，精血得旺，髓海得充，瘀去络通，且滋补而不留邪，降泻而不伤正，补中有泻，寓泻于补。

BDNF及其受体TrkB在脑梗死损伤修复中的作用已逐渐得到肯定。BDNF是神经营养素家族的重要一员，在脑内广泛分布，尤以海马和皮层含量最高[15]。BDNF可促进多种神经元的存活和生长发育，提高神经元的生物活性，减少损伤后神经元的自然死亡，还能促进突触的可塑性，改变脑内神经元的形态，增加突触终末的密度和促进树突、轴突的生长。BDNF发挥生物学效应主要有赖于和其特异性受体TrkB的结合[16-18]。BDNF在海马、大脑皮质的神经元和神经胶质细胞内合成、分泌，经逆行运输到基底前脑胆碱能神经元的胞体，然后作用于胆碱能投射纤维终末的受体TrkB，形成配—受体复合物，后者迅速激活TrkB[19]。当BDNF与TrkB结合后，受体细胞外区构象变化，使受体细胞内区的酪氨酸激酶活性增强。BDNF可通过提高神经元表面的BDNF受体TrkB的表达，对神经元产生生物效应，还可以通过活化BDNF受体TrkB，在细胞内阻断损伤因子的作用[20-21]，从而保护神经元免受缺血性损伤，缩小梗死体积，促进损伤后神经组织的修复，减轻和改善患者症状。

本研究结果显示：与模型对照组比较，桑芪首乌片高、中、低剂量组大鼠给药3周后的神经行为评分明显降低，脑组织BDNF、TrkB阳性细胞数量明显增加，均呈剂量依赖性。表明桑芪首乌片对脑缺血再灌注大鼠的神经细胞有保护作用，对脑梗死后的神经功能康复有促进作用。

综上所述，桑芪首乌片具有神经保护作用，其机制可能与上调脑缺血再灌注大鼠脑组织BDNF、TrkB的表达有关。