扶正抗癌方通过调控Bcl-2家族蛋白促肺癌细胞凋亡

李文娟， 王苏美

（1.广州中医药大学基础医学院，广东广州 510006；2.广州康大职业技术学院，广东广州 511356；3.广州中医药大学第二附属医院/广东省中医院肿瘤科，广东广州 510120）

肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一[1]。在我国，肺癌是男性发病率最高的癌症（22.14%），也是所有最终导致死亡的癌症中的首要原因，其中男性（27.21%）、女性（21.91%）[2]。尽管联合治疗取得了重大进展，但非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的预后仍然很差，所有分期和亚型合并的5年生存率仍然低至11%[3]。中医药（Chinese herbal medicine，CHM）为晚期肺癌患者提供了很好的辅助治疗方法[4-5]，由于其疗效显著、耐药率低、毒性较小而引起了人们的广泛关注。

扶正抗癌方由广东省中医院吴万垠教授首创，用于非小细胞肺癌的治疗已有10多年的历史，疗效显著。本课题组前期研究发现，扶正抗癌方和吉非替尼联合用药与单独使用吉非替尼相比，具有更长的无进展生存期（PFS）以及更小的毒性[6]。同时，扶正抗癌方可以提高NSCLC患者的疾病控制率（DCR）和中位生存期（MST）[7-8]。在分子机制上，扶正抗癌方可通过活化蛋白激酶（AMPKα）介导的胰岛素样生长因子（IGF）与胰岛素样生长因子结合蛋白 1（IGFBP1）以及叉头框蛋白 O3a（FOXO3a）的诱导和相互作用抑制NSCLC细胞的增长，亦证明了其对肺癌具有一定的治疗效果[9]。本课题组近期的研究还发现扶正抗癌方可通过磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）介导的对核因子κB（NF-κB）p65的抑制减少细胞表面相关蛋白（MUC1）的表达，从而抑制NSCLC细胞的增长[10]。以上临床和基础研究为扶正抗癌方阻抑吉非替尼耐药的潜在机制提供了一定的依据。有研究表明，Bcl-2家族是肿瘤细胞凋亡的关键调节因子[11]。因此，本研究以Bcl-2家族成员Bcl-2、Mcl-1基因为切入点进一步探讨扶正抗癌方在肺癌细胞中的促凋亡作用及机制，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞来源及培养 人NSCLC细胞株H1650来源于中国科学院细胞库（中国上海），人NSCLC细胞株A549来源于中山大学实验动物中心细胞库（中国广州）。2种细胞均在37℃、加湿、含体积分数5%CO2和95%空气环境中培养，使用的培养基为RPMI-1640，该培养基含有体积分数10%的胎牛血清（FBS）和0.5%青—链霉素双抗。

1.2 药物及制备 扶正抗癌方颗粒剂由广东康美药业股份有限公司生产，组成：太子参30 g、白术15 g、黄芪30 g、白花蛇舌草30 g、龙葵30 g、石见穿30 g、山慈菇30 g、炒薏苡仁30 g、八月札30 g、蛇泡簕30 g、莪术15 g、甘草10 g。采用高效液相色谱（HPLC）法对不同批次的扶正抗癌方进行一致性分析，采用超高压液相色谱（UPLC）法、LTQ轨道阱质谱法对扶正抗癌方中主要成分的化学结构进行分析[9]。在体外实验中，将颗粒剂溶解在RPMI-1640培养基中，设最终浓度为20 mg/mL，以14 000 r/min的速度离心10 min，再将上清液以0.22μm的除菌过滤器进行过滤，最后将加入扶正抗癌方后的细胞培养环境pH值调整为7.2～7.4。

1.3 主要试剂与仪器 RPMI-1640培养基、青—链霉素双抗（美国Carlsbad Life Technologies公司）；FBS（美国Gibco公司）；膜联蛋白V—异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）凋亡检测试剂盒（美国Louis Sigma-Aldrich公司）；Bcl-2、Mcl-1特异性单克隆抗体（美国Beverly Cell Signaling Technology公司）；ECL发光液（德国Millipore公司）。Counter Star自动细胞计数（美国Denver Inno-Alliance Biotech公司）；HPLC检测解决方案系统（250 mm×4.6 mm，5μm，苏格兰ACE公司）；Beckman FC 500流式细胞仪（美国Beckman公司）；Infinite M1000 PRO多功能酶标仪（瑞士Tecan公司）；Bio-Rad ChemiDoc XRS+化学发光成像系统（美国Bio-Rad公司）。

1.4 观察指标与方法

1.4.1 HPLC分析扶正抗癌方的稳定性 采用HPLC检测解决方案系统对初始批次的扶正抗癌方的一致性进行研究。流动相由0.1%甲酸的去离子水（A）和0.1%甲酸的乙腈（B）组成。梯度洗脱方案为0～5 min时5%B，5～10 min时5%～20%B，10～15 min时20%～40%B，15～40 min时40%～95%B，40～45 min时95%～100%B。流速为1.0 mL/min，检测波长为280 nm，注入量为10μL，反应柱的温度维持在30℃。

1.4.2 流式细胞技术观察细胞凋亡情况 按照Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明书进行细胞凋亡检测。简要步骤：将NSCLC细胞株（A549、H1650）接种到六孔板上，经过24 h的培养后，向六孔板中加入递增剂量（0、0.5、1.0、1.5 mg/mL）的扶正抗癌方继续在37℃的环境下培养24 h。然后收集细胞，以1 500 r/min的速度离心5 min，再加入1×的binding buffer进行重悬并转移到流式管中，最后加入5μL AnnexinV-FITC和5μL PI，混合均匀后室温放置15 min，待反应完全后用流式细胞仪分析细胞。

1.4.3 蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测细胞Bcl-2、Mcl-1的蛋白表达 将不同剂量（0、0.5、1.0、1.5 mg/mL）扶正抗癌方培养24 h后的H1650、A549细胞收集后用预冷的PBS洗涤，加入1×RIPA buffer裂解，刮取蛋白，用Thermo BCA蛋白分析试剂盒检测蛋白浓度。将等量的蛋白溶解于5×十二烷基硫酸钠（SDS）样品缓冲液中，经8%～10%SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离，转移到PVDF膜上。50 g/L脱脂奶粉（以TBST溶解）封闭后，分别加入一抗Bcl-2、Mcl-1抗体在4℃环境下孵育过夜。次日用TBST洗膜3次后，用二抗兔抗IgG孵育1 h，再洗膜3次。随后用现配的ECL发光液浸润PVDF膜后在Bio-Rad ChemiDoc XRS+化学发光成像系统下扫描，所得结果用Imagine J软件进行测量分析。

1.5 统计方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，所有数据均以均数±标准差(-x±s)表示。数据分析的统计评价采用t检验，当只有2组（双侧）时和组间差异评估采用单向方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同批次扶正抗癌方HPLC色谱图 采用HPLC对不同批次扶正抗癌方的主要成分进行了鉴别。图1结果显示，4种批次扶正抗癌方溶液的HPLC色谱图案相似，表明扶正抗癌方具有良好的稳定性。

图1 不同批次扶正抗癌方HPLC色谱图Figure 1 HPLC result for different batches of Supporting Healthy Qiand Anti-cancer Recipe

2.2 扶正抗癌方诱导肺癌细胞凋亡 应用0、0.5、1.0、1.5 mg/mL扶正抗癌方处理NSCLC细胞株H1650、A549并培养24 h后，采用流式细胞技术观察对细胞凋亡的影响。结果如图2、3中象限A02、A04所示，扶正抗癌方促H1650、A549细胞凋亡作用呈显著的剂量依赖性（1.5 mg/mL扶正抗癌方处理组差异超过50%）。图2-B、3-B显示，药物处理24 h后，扶正抗癌方诱导组（0.5、1.0、1.5 mg/mL）凋亡率明显高于未处理对照组（0 mg/mL）。

2.3 Bcl-2家族参与了扶正抗癌方诱导肺癌细胞的凋亡 为进一步阐明扶正抗癌方诱导肺癌细胞凋亡的分子机制，本研究检测了Bcl-2家族成员的2种抗凋亡基因Bcl-2、Mcl-1在扶正抗癌方处理的H1650和A549细胞中的蛋白表达。图4、5结果表明，在扶正抗癌方处理的H1650和A549细胞中，Bcl-2、Mcl-1的蛋白表达水平均呈剂量依赖性下降。

图2 扶正抗癌方诱导H1650细胞凋亡结果Figure 2 The results of Supporting Healthy Qiand Anti-cancer Recipe inducing the apoptosis of H1650 cells

图3 扶正抗癌方诱导A549细胞凋亡结果Figure 3 The results of Supporting Healthy Qiand Anti-cancer Recipe inducing the apoptosis of A549 cells

图5 扶正抗癌方处理的H1650、A549细胞Mcl-1的蛋白表达Figure 5 The protein expression level of Mcl-1 in H1650 and A549 cells treated with different dosages of Supporting Healthy Qiand Anti-cancer Recipe

3 讨论

中医认为，肺癌属于“肺积”“肺痈”“息积”“息贲”等范畴。肺癌病因病机尚未统一，但综合多家之说认为肺癌是本虚标实，因虚而致实，全身属虚、局部属实的疾病。因正气虚损、阴阳失调，邪毒（烟毒、秽浊之气）乘虚入肺，邪滞于肺，导致肺脏功能失调，肺气膹郁，宣降失司，气机不利，血行受阻，津液失于输布，津聚为痰，痰凝气滞，瘀阻络脉，使痰瘀毒互结，日久形成肺部积块。吴万垠教授根据肺癌的证型分布，采用“辨证+辨病”的中医治疗肿瘤原则，创制扶正抗癌方。扶正抗癌方以四君子汤为基础方。方中太子参补气养阴生津，黄芪补气升阳、益卫固表，白术健脾燥湿化痰，炒薏苡仁健脾渗湿，甘草益气补中、调和诸药，五药同用有健脾益气补肺化痰之效。山慈菇清热解毒、消痈散结，白花蛇舌草、龙葵清热解毒，石见穿活血化瘀、清热散结，八月札活血理气，蛇泡簕清热散瘀，莪术破血行气消积。组方从整体观念出发，辨证与辨病相结合。扶正则重视补益肺脾之气，祛邪则以清热解毒、祛瘀散结抑瘤为主，上药合用共奏扶正抗癌之功[12-13]。

本课题组前期研究发现，扶正抗癌方可通过激活Caspase-3、Bax诱导H1650细胞的凋亡。为此我们考虑扶正抗癌方是否能够通过其他通路对肺癌细胞凋亡起作用。本研究旨在揭示扶正抗癌方对肺癌细胞凋亡的影响及其机制。流式细胞术结果表明，扶正抗癌方可能通过诱导肺癌细胞凋亡发挥细胞毒性作用。

目前，细胞凋亡有2种被广泛接受的经典途径：线粒体途径和死亡受体途径[14-15]。线粒体在细胞凋亡过程中起着关键作用，它调控并参与肿瘤细胞凋亡的全过程[16]。线粒体外膜的通透性主要受到Bcl-2蛋白家族的调控。Bcl-2是线虫凋亡分子Ced-9在哺乳细胞中的同源物，家族成员大多定位在线粒体外膜上，或受信号刺激后转移到线粒体外膜上。根据既往研究可知，Bcl-2蛋白家族中的促凋亡因子Bax能沿细胞质转移到线粒体外膜，进而增强线粒体膜的通透性。因此，当Bax水平升高而跨膜电压下降时，位于线粒体中的蛋白质如细胞色素可被释放，从而引起一系列反应，在肿瘤细胞中发生细胞凋亡[17-19]。另一项研究[20]表明，一种强心类固醇药物bufalin可降低几种不同类型的癌症中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达和生存，并提高促凋亡蛋白Bax/Bcl-2的表达率。这些研究结果表明Bcl-2蛋白家族在细胞凋亡中起关键作用。与此一致，我们研究发现，扶正抗癌方可抑制Bcl-2家族中抗凋亡基因Bcl-2、Mcl-1的蛋白表达。

综上所述，扶正抗癌方诱导的细胞凋亡是通过调控Bcl-2家族蛋白的表达来实现的，其可通过调控Bcl-2家族促进肺癌细胞发生细胞凋亡从而发挥其治疗肺癌的作用。本结果进一步揭示了扶正抗癌方作为肿瘤抑制化合物抑制肺癌细胞生长的新机制。