青海西宁牦牛病毒性腹泻疫病病原学调查与分析

杨秀玲,李志强,罗永珍,芦光花

(1.青海省湟源县城关镇畜牧兽医站，青海 湟源 812199；2.青海省湟中县上五庄镇畜牧兽医工作站，青海 湟中 811600；3.青海省湟源县东峡乡畜牧兽医站，青海 湟源 812100；4.青海省湟中县畜牧兽医站，青海 湟中 811600)

牦牛为我国特有珍稀牛种之一，分布于青藏高原，是我国藏族人民衣食住行烧耕的主要来源，近年来随着我国对特种动物养殖扶持政策的不断完善，各种补助的不断提高，牦牛的规模化舍饲养殖得到了快速与盲目发展，但由于舍饲养殖导致了牦牛生活习性的改变，致使牦牛腹泻性疫病增多，影响了牦牛产业的稳定发展。引起牦牛腹泻的原因较多，主要包括营养性腹泻、细菌感染、病毒感染以及寄生虫感染等，其中以病毒性腹泻的危害最为严重。而引起牦牛病毒性腹泻的致病原主要有牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛轮状病毒(BRV)、牛肠道病毒(BEV)、牛冠状病毒(BCV)和牛星状病毒(BAstV)[1-5]。为全面掌握青海省西宁市牦牛群中病毒性腹泻各种致病原的感染现状，本试验采用RT-PCR方法首次对2017年采集于西宁市下属6各县的74份具有腹泻症状的牦牛粪便样品进行了BVDV、BRV、BEV、BCV和BAstV的核酸检测，并对检测结果进行了单独感染与混合感染的统计与分析，为西宁市牦牛腹泻性疫病的防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源 2017年共采集青海省西宁市城东区、城西区、城北区、湟源县、湟中县、大通县等部分地区牦牛养殖场和散养户中具有明显腹泻症状的牦牛新鲜粪便样品共计74份。

1.2 主要试剂与试剂盒 病毒基因组RNA提取试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司；一步法RT-PCR扩增试剂盒、DL-2 000 DNA Marker，均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 检测样品的处理 将采集的新鲜粪便样品加入3倍体积灭菌生理盐水中，碾磨、反复冻融3次，10 000 r/min离心10 min，吸取上清液即得处理后的检测样品，-20 ℃保存备用。

1.4 样品基因组RNA的提取 利用病毒基因组RNA提取试剂盒分别提取74份腹泻牦牛检测样品的病毒基因组RNA。

1.5 引物设计与合成 分别根据参考文献[5]、[6]、[7]设计,针对BVDV、BRV、BEV、BCV、BAstV的特异性检测引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。

表1 引物信息

1.6 RT-PCR扩增 以提取的74份牦牛腹泻样品的基因组RNA为模板，分别利用合成的BVDV、BRV、BEV、BCV、BAstV特异性检测引物进行RT-PCR扩增(RT-PCR扩增信息见表2)，RT-PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测分析。

表2 RT-PCR扩增信息

1.7 感染情况统计分析 对74份牦牛腹泻样品的BVDV、BRV、BEV、BCV、BAstV检测结果进行统计，分析5种致病原的单独感染与混合感染情况。

2 结果与分析

2.1 RT-PCR检测结果 采用RT-PCR方法分别对西宁市下属6个县市的74份腹泻牦牛样品进行了BVDV、BRV、BEV、BCV、BAstV的病原学检测，结果如表3所示，共检测出BVDV阳性样品28份(部分样品电泳图如图1所示)，平均阳性率为37.84%，6个县市均存在BVDV感染，以湟源县的阳性感染率最高，达47.62%。共检测出BRV阳性样品20份(部分样品电泳图如图2所示)，平均阳性率为27.03%，除城西区以外的5个县市均存在BRV感染，以湟源县的阳性感染率最高，达38.10%。共检测出BEV阳性样品17份(部分样品电泳图如图3所示)，平均阳性率为22.97%，6个县市均存在BEV感染，以湟源县的阳性感染率最高，达28.57%。共检测出BCV阳性样品4份(部分样品电泳图如图4所示)，平均阳性率为5.41%，感染区域主要集中在湟源县、湟中县、大通县，以湟源县的阳性感染率最高，达9.52%。共检测出BAstV阳性样品2份(部分样品电泳图如图5所示)，平均阳性率为2.70%，感染区域主要集中在湟源县和湟中县，感染率分别为4.76%和6.25%。该结果表明，西宁市大部分地区均存在BVDV、BRV、BEV、BCV、BAstV的流行，其中以湟源县的流行最为严重。而引起西宁市牦牛病毒性腹泻的主要致病原为BVDV、BRV、BEV，其中以BVDV的感染最为严重。

表3 不同地区的检测结果

图1 部分样品BVDV RT-PCR扩增结果

M ： DL-2 000 DNA Marker；2、3、5、7 ：阳性样品；1、4、6、8：阴性样品

图2 部分样品BRV RT-PCR扩增结果

M ： DL-2 000 DNA Marker；2、3、6 ： 阳性样品；1、4、5、7：阴性样品

图3 部分样品BEV RT-PCR扩增结果

M：DL-2 000 DNA Marker；2、3、5、7：阳性样品；1、4、6、8：阴性样品

图4 部分样品BCV RT-PCR扩增结果

M:DL-2 000 DNA Marker；1、2:阳性样品； 3、4、5、6:阴性样品

图5 部分样品BAstV RT-PCR扩增结果

M:DL-2 000 DNA Marker；2:阳性样品； 1、3、4、5、6、7:阴性样品

2.2 单独感染与混合感染的统计分析 对74份牦牛腹泻样品的检测结果进行BVDV、BRV、BEV、BCV、BAstV 5种致病原单独感染与混合感染的统计与分析，结果如表4所示，在单独感染方面，共存在BVDV、BRV、BEV、BAstV 4种致病原的单独感染，其中以BVDV的单独感染率最高，达16.22%。在混合感染方面，共存在BVDV/BRV、BVDV/BEV、BVDV/BCV、BRV/BEV、BRV/BCV、BVDV/BRV/BEV、BVDV/BRV/BCV 7种混感型，其中以BVDV/BEV和BVDV/BRV的混合感染较严重，混感率分别达8.11%和6.76%。该结果表明，引起西宁市牦牛病毒性腹泻的原因主要有BVDV、BRV、BEV、BAstV 4种致病原的单独感染以及BVDV、BRV、BEV、BCV、BAstV 5种致病原的混合感染，且混合感染型较多，混合感染情况较复杂、较严重。

表4 单独感染与混合感染的统计分析

3 讨论

近年来，随着牦牛养殖产业的快速发展，牦牛病毒性腹泻疾病的发生率也逐渐增多，逐步引起我国研究学者的重视，开展了大量的牦牛病毒性腹泻疾病相关致病原的流行病学调查。陈新诺等[8]采用RT-PCR方法对四川和西藏部分高原地区采集的149份临床腹泻牦牛粪便样品进行了BVDV的检测，BVDV阳性检出率为19.46%，其中西藏地区牦牛BVDV阳性检出率为27.14%，四川地区牦牛BVDV阳性检出率为12.66%。陈新诺等[9]应用RT-PCR对青藏高原地区(西藏、青海、四川和云南)共计222份出现腹泻症状的牦牛粪便样品进行了BVDV和BEV的病原学检测，BVDV阳性检出率为20%，BEV阳性检出率为29.4%，BVDV/BEV混合感染阳性率为4.8%。柳清[10]采用ELISA试剂盒对青海省6个规模牦牛饲养场和11户散养户的559份血清样品进行了BVDV抗体检测，BVDV平均阳性率为36.14%，规模牦牛场平均阳性率为34.19%，散养户平均阳性率为39.42%。戴源森等[11]采用ELISA抗体检测法和RT-PCR抗原检测法对青海省海北州门源县及周边县的712份牦牛血清样品进行了BVDV抗体与抗原的检测，BVDV抗体平均阳性率为21.21%，BVDV抗原平均阳性率为22.19%。权英存等[12]采用RT-PCR方法对青海省部分地区的32份具有腹泻症状的临床病料进行了BVDV、BRV、BCV的核酸检测与分析，BVDV、BRV、BCV的阳性率分别为65.63%、18.75%、34.38%。为丰富西宁市牦牛病毒性腹泻疾病致病原的流行病学资料，本试验于2017年在西宁市境内共采集了牦牛规模养殖场和散养户的腹泻牦牛样品74份，采用RT-PCR方法分别对其进行了BVDV、BRV、BEV、BCV、BAstV 5种致病原的病原学检测与分析，结果显示，BVDV、BRV、BEV、BCV、BAstV平均阳性感染率分别为37.84%、27.03%、22.97%、5.41%、2.70%，表明西宁市大部分地区均存在BVDV、BRV、BEV、BCV、BAstV的流行，以BVDV、BRV、BEV的感染较为严重，其中本试验中西宁市腹泻牦牛BVDV感染率略高于陈新诺等[8-9]调查的四川和西藏、青海和云南地区以及戴源森等[11]调查的青海省海北州门源县，略低于权英存等[12]调查的青海省部分地区。同时本试验发现西宁市腹泻牦牛群中存在多种致病原的混合感染，且混合感染型较多，混合感染情况较复杂、较严重，混合感染不但增加了疫病的诊断难度，同时对牛群造成的危害和经济损失更加严重，应加强重视。笔者呼吁加强对牦牛病毒性腹泻疫病的重视，加强对致病原的监测，对感染牦牛应及早淘汰和无害化处理，逐步建立和维护无病牛群，保障青海牦牛养殖业的快速与健康发展。