可注射性材料应用于骨组织工程的研究进展*

王斌 林剑浩 卫小春**

（1.山西医科大学第二医院骨科，太原 030001；2.北京大学人民医院骨关节科，北京 100004）

近些年，骨组织工程发展迅速，被视为自体骨或同种异体骨移植的替代[1]，同时可以克服骨移植所带来的种种弊端：①自体骨移植时供区有限，供区疼痛；②异体骨移植时有发生感染、传递疾病的风险；③由于加工方法不一，导致结局不一致，且有免疫反应，进而导致受体区域无法愈合[2]。理想的骨组织工程材料可以解决上述骨移植所带来的弊端，但需满足以下几点[3]：首先，良好的生物相容性、优化的孔隙率、可降解性以及一定的抗机械压力。其次，能够释放生物小分子，促进血管生成等。随着精准医疗以及微创医学的发展，可注射性材料以其易于操作、创伤小的特点日益受到重视，本身也更符合支架制作的4F 原则[4]：Form（形状），Function（性能），Formation（功能），Fixation（可植入性）。理想的可注射性材料还应具备良好的注射性及塑形性，满足手术需要，减少瘢痕产生，缩短愈合时间和手术时间，并发症少，材料来源广泛，价格低廉，易于消毒及保存等[5]。

1 可注射水凝胶

目前，最常用作可注射的材料是水凝胶[6]，其可通过物理交联、化学交联快速成胶。水凝胶的基本特点：具备类细胞外基质的结构，其三维水化网络结构能更好地模拟细胞外基质的物理和化学微环境，进而促进细胞的增殖、分化以及新生细胞外基质的分泌，最终用于修复损伤组织。水凝胶具有良好的可注射性，满足任何形状与大小的缺损，已在药物运输、细胞运输、组织工程、再生医学等领域得到广泛应用[7,8]。水凝胶的缺点：首先，有限的孔隙率仅能满足培养基、代谢产物、营养物质的流通，不是保证细胞在其内的增殖[9]。其次，在成胶过程中，水凝胶本身的机械强度、吸收强度难以控制，一定程度上限制其特定的应用。

2 天然可注射水凝胶

天然水凝胶包括壳聚糖、透明质酸（hyaluronic acid，HA）、胶原、明胶、纤维蛋白凝胶、海藻盐等。天然水凝胶的缺点：缺乏机械强度，大规模获取困难，不同生产批次的产品存在差异，降解时间难以控制，有传播某些传染性疾病的隐患、抗原性消除不确定等。

2.1 壳聚糖

壳聚糖是一种天然衍生氨基多糖类，其具有良好的生物相容性、可降解性、抗感染、抗真菌、抗癌、抗氧化等[10]。壳聚糖在弱酸环境中可与一些负离子相互作用或经戊二醛交联形成水凝胶，也可在体温状态时成胶，从而实现微创注射[11]，进而用于携带与保护细胞，方便细胞间营养物质及代谢的流通[12]。然而，由于壳聚糖含有较多胺基和比较高的结晶度，导致其很难溶解于一般的有机溶剂，甚至是中性的水介质中，只能酸溶或溶于酸性水溶液，极大限制了其应用。同时和其他水凝胶一样，壳聚糖的水凝胶力学性能较低[13]。

2.2 HA

HA 是细胞外基质的主要成分，是一种由氨基葡聚糖（glycosaminoglycans,GAG）组成的多糖。可通过热凝胶化，也可与多种酰肼化合物及双环氧化物交联，还可通过碳二亚胺交联、蛋白质桥交联、光交联等共价交联形成水凝胶[6]。HA 本身无免疫原性，目前被广泛用于治疗骨关节炎，还用于药物传递[14]以及制作DNA 质粒、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP)-2的载体[15]。HA 的缺点：纯HA 易溶于水，吸收降解速度快，需要纯化以除去杂质和内毒素。HA 的力学性能较差，在温度超过90℃时容易受损，且不易被脱水，这些都限制了HA的使用[16]。

2.3 胶原

胶原本身是一个生物可吸收的、自然结构的蛋白[17]，用来构成细胞外基质的骨架。在体内以胶原纤维的形式存在，肌腱与骨中超过90%的细胞外蛋白是胶原。胶原蛋白的基本结构单位是原胶原，可通过物理（热交联、紫外线、C射线交联）或化学（酰基叠氮、聚环氧化物）交联[18]。胶原多采用化学交联，如采用戊二醛交联方法成胶，可在生物的发育、生长、细胞分化及黏附、化学趋向及抗原抗体结合反应中发挥重要作用，因而被广泛用于细胞黏附，提高组织修复[19]以及组织工程与基因治疗等。骨组织的细胞外基质（extracellular matrix,ECM）为Ⅰ型胶原，实验证明其对成骨细胞吸附、生长，诱导干细胞成骨分化而发挥巨大作用[20]。胶原的缺点：其物理凝胶具有热可逆性，力学强度差。单独使用时缺乏一定的机械强度，难于塑形，理学性质不稳定，因而常需与其他材料复合。

2.4 明胶

明胶是由胶原蛋白不可逆降解获得的高分子量多肽混合物，由多种氨基酸组成。明胶不溶于冷水，可溶于热水，可缓慢吸水膨胀软化，吸收其重量5～10倍的水[21]。由于明胶是典型的两亲性聚电解质，明胶水溶液在温度降至35℃以下时形成可逆性凝胶[21]，是一种有一定硬度但不流动的半固体弹性物质，明胶也可以通过化学交联。明胶多来源于动物的骨、软骨、皮肤等结缔组织中的胶原蛋白，因此保持很好的生物相容性[22]。明胶的特点：成膜性好，具有表面活性，可降解，降解产物易被吸收而不产生炎症反应，已经在医药、生物材料领域有广泛的应用[23]。明胶的缺点：与胶原类似，缺乏一定的机械强度，难于塑形，理学性质不稳定，因而常需与其他材料复合[24]。

2.5 纤维蛋白凝胶

纤维蛋白凝胶是血液成分之一，可以用来介导细胞间的黏附和运动，是一种无毒、无免疫原性、具有良好生物相容性和生物降解性的物质[25]。纤维蛋白凝胶由自身血液制备，避免了免疫原性问题，可直接用于临床，具有取材简单、制备方便、韧性好等优点[26]，在组织工程心肌梗死的治疗中具有很好的应用前景[27]，还可作为核酸的转运载体[25]。纤维蛋白凝胶的大小和形状能够根据需要而塑形，是较理想的骨生长因子缓释载体和细胞外基质材料[28]。纤维蛋白凝胶的缺点：缺乏机械强度，大量获取困难，无法控制降解时间，难以单独作为组织工程的支架材料，需与其他材料相合成，如与BMP结合[29,30]。

2.6 藻酸盐

藻酸盐是藻酸的盐类。藻酸盐溶于水后通过离子交联、自由基交联，藻酸盐呈溶胶状态，分子量越大，形成的溶胶越黏稠[31]。其被广泛应用于食品工业，外带熬制商品及药品转运[32]。藻酸盐的缺点：凝胶时间难以控制，导致最终结构均一性差，机械性能不足。缺乏与细胞的特异性作用，缺乏对细胞的特异性吸附位点，不易被酶消化降解。

3 合成的可注射水凝胶

合成的可注射高分子及其复合物包括：聚乳酸（polylactide acid,PLA）、聚乙二醇（polyethylene gly‐col,PEG）、聚酸酐、聚富马酸（polypropylene fumarate,PPF）、聚磷酸酯（polyphosphoester,PPE）、N-异丙基丙烯酰胺（N-isopropyl acrylamide,NIPAAm）等。合成的可注射水凝胶是一类生物相容性好的可降解材料，能够在体内分解成二氧化碳、甲烷、水及无机小分子。不同于传统的可注射物，这些材料可因体温、Ph值、光以及阳离子在局部发生交联[33]。合成的可注射水凝胶拥有不同的孔隙率、孔径、降解速率、机械性能，进而可通过模塑、挤压等加工成各种结构形状，其固化形成的三维网络可为组织再生提供合适的力学强度。合成的可注射水凝胶的缺点：亲水性差，细胞吸附力较弱，可引起无菌性炎症，机械强度不足，残留酸性降解产物的细胞毒作用，光引发交联难以实现深层的原位固化；其次，体液对于自由基反应易造成材料表面固化不完全。

3.1 PLA

PLA是以乳酸为主要原料聚合得到的聚合物，分子中有一个不对称碳原子，可形成不同构型的聚合物[34]。其降解与吸收率取决于分子量、结晶度、链的取向以及植入物的尺寸等因素。PLA属热塑性塑料，其具备生物相容性、可降解性、良好的机械性能以及一定的抗拉性等。通过原位聚合技术可以在体内构建支架材料，因而在软骨、骨、肌腱、小肠、气管、心瓣膜等得到广泛应用。PLA 的缺点：纯的PLA 硬而脆，加工难度大且不耐热等，严重影响了其在注塑方面的应用。整体费用偏高。聚乳酸降解时间最长，植入体内5年仍可能存在。

3.2 PEG

PEG 由环氧乙烷与水或乙二醇聚合而成。本品溶于水、乙醇和许多有机溶剂，有良好的吸湿性、润滑性、粘连性。无毒，无刺激，通过可见光或紫外光交联，形成水凝胶。该方法具备快速成胶、所成胶机械性能强、毒性小、操作简易等优点[35]。PEG是目前经过FDA认证，广泛应用于临床的一类可注射性聚合物，多以水凝胶的状态出现，凝固后形成多孔支架，广泛应用于不需要血管化的组织中，比如血管与软骨。PEG的缺点：大分子单体合成的PEG在体外很少降解。

3.3 聚酸酐

聚酸酐是一类新型的医用高分子材料，其合成方法有熔融缩聚、开环聚合、界面聚合、溶液聚合等[36]。分子中含有的酸酐键具有不稳定性，能水解成羧酸，其各自结晶度不同，导致其溶解性不同。常通过紫外光或可见光交联，用以改善力学性能。聚酸酐较脆，交联后的聚酸酐具有较高的力学强度以及相对较慢的降解速度，引起的炎症反应小，多用于骨钉及可吸收填充物，也可用于骨组织工程支架材料[37]。聚酸酐的缺点：单独的聚酸酐较脆，其降解为表面溶蚀作用，无定型区更易发生表面溶蚀和降解，其降解呈自加速现象，需通过添加不同的物质来控制其降解[38]。

3.4 PPF

PPF（1，2-丙二醇酯）是一种疏水性的线性分子，主链中的酯基在生理条件下可水解，因而具有生物降解性能，可通过光或热引发原位交联聚合成三维网络结构，应用于可注射骨修复材料。PPF 为不饱和聚酯，聚酯材料的疏憎水性导致细胞的黏附性较差，不具有成骨活性，有必要通过接枝一些小分子来改善材料的亲水性，同时提高材料的成骨活性。

3.5 PPE

PPE 的分子结构上与生物高分子如核酸及磷壁酸等具有相似性，磷酸酯键在生理条件下可水解或酶促分解，因而具有良好的生物相容性和可降解性。某些PPE甚至是水溶性的，可通过光或离子引发交联形成PPE 水凝胶。改性后可具备PPE 所具备的可注射性、原位交联固化能力以及可降解性能，同时改善PPE的亲水性能，提高生物相容性。其广泛应用于骨组织工程[39]。

3.6 NIPAAm

NIPAAm 是丙烯酰胺衍生物单体，是一种最具代表性的温敏性聚合物。该聚合物的水溶液在低临界溶解温度（lower critical solution temperature,LCST）下呈溶液态，高于LCST形成凝胶[40]。通过NIPAAm的接枝修饰可改善或提高细胞在凝胶内的生存能力和细胞形态，促进细胞增殖、分化和细胞外基质的分泌。

4 骨水泥

骨水泥已广泛应用于生物工程领域及临床，其拥有不用的种类、孔隙率、孔径大小以及拓扑结构[1]。对于可注射性骨水泥可分成四类：硫酸钙（calcium sulfate cement,CSC）、磷酸钙（calcium phosphate,CPC）、丙烯酸骨水泥及其合成的产物。理想的骨水泥应具备：①方便注射以及在注射过程中保持一致性；②合适的凝固时间；③较低的坏死风险；④合适的抗拉力、抗压力以及抗剪切力；⑤与周围骨的破度相同；⑥在X线下易识别；⑦良好的生物相容性；⑧吸收速率与骨形成速率相仿；⑨大的孔隙率方便代谢，血管化以及骨整合。骨水泥的凝固时间分为初凝时间及终凝时间，初凝时间是指骨水泥从调和开始到失去塑形性，但还不具备机械强度的时间；终凝时间是指骨水泥从调和开始到完全失去塑形性且完全具备机械强度的时间[41]。

4.1 CSC

CSC是由硫酸钙二水化合物组成的矿物质，目前医用多为半水硫酸钙（calcium sulfate hemihydrate,CSH），微溶于水，溶于酸和铵盐。CSC 具有可塑性、原位自固化、良好的生物相容性。其具有来源广泛、较强的骨传导活性，良好的微孔性等优势，是理想的骨移植替代材料。CSC无细胞毒性，体外细胞培养研究证实成骨细胞可贴附在CSC表面生长，因此具有潜在的骨诱导活性，该机制与硫酸钙溶解过程中局部微环境有关[42]。另外，CSC 还可以为血管和成骨细胞的长入提供骨引导性的基础。CSC的缺点：降解速率较快，远快于新生骨的生成速率，无法提供短期体内的机械支撑。CSC骨水泥由于其较低的生物活性，其在治疗早期与骨组织缺乏较好的化学键结合力[43]。

4.2 CPC

CPC 是一种非陶瓷的羟基磷灰尘石类人工骨生物材料，由固相与液相按一定比例混合而成，在短时间内自行固化，最终生成与骨组织无机成分相似的磷灰石。CPC具有良好的生物相容性、降解活性以及成骨诱导活性[44]，CPC 在临床上的应用较CSC 更为普遍，现已广为使用。作为可注射材料，CPC 骨水泥已经作为上市产品。CPC 骨水泥固化放热量小[45]，在体内逐步被组织吸收并产生骨再生效果，具有直接引导骨形成的作用。其最终降解产生大多为沉积的羟基磷灰石（hydroxyapatite,HA）和二水磷酸氢钙。CPC的缺点：固化时间长，黏结性能差，抗水性能不足，初凝阶段接触体液易崩解，未固化的微纳米粉体一旦进入心血管系统则会造成血管堵塞。机械性能较差而需要通过CPC-纤维结合提高其拉伸强度[46]。

4.3 HA

HA 是一种经典的骨修复材料。HA 的特点：生物相容性好、免疫原性低、成骨活性佳等优点。其成骨机制：植入人体后，在体液作用下释放材料表面的钙和磷，被机体组织吸收，并与人体骨组织形成牢固的化学键合，生长出新组织。HA 的缺点：单一组成的塑形性能较差、体内降解较慢，固型性能不佳，不适合于注射使用[47]。可注射性材料中含有的纳米微粒有助于宿主与注射物之间产生反应，同时使其更具有生物相容性以及骨传导性，有利于骨组织整合，更适合细胞生长[48]。HA 还可以提高材料的机械性能，如抗张力、抗压缩力、抗剪切力以及抗断裂的韧性，使骨植入体的扭转模量、拉伸模量和拉伸强度均得到提高。HA 可以释放离子或者药物到周围，用以加强成骨细胞募集、黏附、增殖、分化[49]。

4.4 硅酸钙（calcium silicate，CS）

CS 骨水泥作为一种含有硅的生物活性材料。传统CS应用于磷灰石的表面刺激体液及其余磷酸化液体反应（通过释放硅离子很快形成一层羟基磷灰石层）[50]，可以提高单纯HA 的体内生物活性。同时，CS浸析物不会影响细胞代谢活动，可用于体外干细胞的诱导[51]。另外，CS 对于干细胞的增殖及成骨均有效。CS的缺点：材料断裂强度低、弹性模量高，可通过制备与有机聚合物相结合的生物活性复合材料来解决[52]。

5 生物玻璃（bioglass，BG）

BG 可通过释放钙、磷、锶离子促进成骨细胞黏附、增殖、分化与矿化[53]，与骨或软组织形成牢固的化学键合，具有良好的生物相容性和成骨诱导活性。BG 产生的离子可以激活一系列成骨分化基因（如巨噬细胞集落刺激因子、血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子）来促进增殖，保持活性与矿化，以及促进新生血管形成的作用。目前对于BG 材料主要制备成固态，而可注射性CPC-BG 材料，经验证可用于骨再生以及良好的骨长入[54]。通过添加BG 延长凝固时间，以提高可注射性，增加机械应力与即时稳定性，还可以加快吸收时间。

6 聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA）

PMMA的特性：粉末状的PMMA与液体混合后可以注入，后迅速发生聚合反应，占据缺损区域。PMMA的优点：可操作性较好，具有良好的生物性能，生物相容性良好。可以通过添加氧化锆以及硫酸钡增加显影，可以添加抗生素来增加抗感染能力。其通过渗入骨小梁间隙提供把持力。PMMA的缺点：由于现场固化会达到90 摄氏度甚至更高温，可能引起周围组织坏死，且不可降解，易导致骨吸收，影响骨折愈合，残留单体及引发剂存在细胞毒性。且其与周围骨小梁不产生反应，因此也不被人体吸收。但上述缺点可以通过与其他物质结合而得到改善，如添加BG[55]或与甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷结合提高其生物活性[56]。另外，PMMA 的另一个缺点是硬度比松质骨高很多，会导致应力遮挡效应，最终减弱周围宿主骨量。此外，PMMA使用时并发症较多，如低血压、心脏骤停，还有诸如血管栓塞、高热等。

7 总结

单一使用一种材料构建的可注射性材料作用比较有限，其中生物类材料虽消除了部分抗原性，具有多孔性，但力学强度欠佳，降解过快。钙磷陶瓷类虽有三维孔隙结构，骨亲和力强，材料表面微碱环境有利于成骨细胞贴和增殖，但脆性大，降解难控制。天然高分子虽有良好的生物相容性，有利于成骨细胞贴附、增殖和分化，但缺乏机械强度，难以单独作为成骨细胞的支架材料。学者们正不断尝试将其他的一些天然或合成的生物性能良好的材料进行有效的交联，力图发挥各自材料的优点，弥补对方的缺点，构建一种能发挥多种功效、智能的、复合型可注射支架材料。

理想的可注射支架材料应具备合适的孔隙率及孔径大小，能够成为骨类生长因子良好的载体，并且具备可调控的释放速率，促进成骨细胞黏附、增殖、分化，发挥其最大的成骨潜能。目前大多数可注射性材料关注的方向多为可注射性和机械性能，对于细胞与材料的相容性以及细胞的最大存活度关注较少，目前，经潜心研究设计的一种有助于最大程度保证细胞存活的微冰胶支架[57,58]，适合于细胞载荷，从而避免在水凝胶成胶过程中对细胞的损害，而且可以为细胞增殖提供更广的空间。多孔的冰胶可以设定体积与形状，而且相对更坚固，有助于作为可注射性材料中良好的细胞载体。细胞可以提前种植到材料内，进行体外培养，最大程度避免将种植细胞直接暴露在缺血与炎症环境内。这类微冰胶同时可以保护细胞在注射过程中免受机械损伤，最大程度保证细胞的体内存活率，而且极大减少了所需细胞的数量。应用制作微冰胶的技术可以用于制作骨修复材料，最大程度满足合成材料的生物特性及成骨诱导特性[59]。