不同酵母菌发酵对生姜梨酒品质的影响

曾智娟，邓杰,2，任志强,2，张兰兰，车路萍，卫春会,2*，黎仲冰

1(四川轻化工大学 生物工程学院，四川 宜宾，644000) 2(酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川 宜宾，644000) 3(中国人民解放军原济南军区新技术农副业生产基地，山东 邹城，273517)

梨营养丰富，口味极佳[1]，近年来，梨产量不断增大，据中国农产品年鉴显示，2017年梨产量达 1 641万t，位居全国水果产量第三，全世界梨产量第一。但梨果面临保鲜时间短、运输困难、深加工途径少等问题，希望通过加工梨成酒的方式增加其深加工途径，减缓梨果滞销现状，对国家扶贫攻坚政策给予支持。

生姜梨酒是以梨、生姜为原料经破碎、榨汁等处理后按照一定配比混合发酵的新型果酒[2]。其汲取梨中丰富的维生素和氨基酸等营养物质，又汲取生姜中的姜油酮和辛辣成分，既融合了梨生津、清热、润燥的功效，又融合了生姜驱寒、和胃、祛风的功效，具有增强人体内分泌、提高免疫功能、抗氧化等作用。生姜梨酒发酵过程中产生的香气成分、酒精度、有机酸等决定着果酒风味及口感。关于梨酒的研究，目前主要集中在梨品种对比[3]，发酵工艺的优化[4-5]、酵母种类的筛选[6-7]、梨酒香气成分[8-9]等方面研究，但由于大多发酵采用葡萄酒酵母酿造，缺乏专用梨酒酿酒酵母，这制约了高品质生姜梨酒生产。

本研究利用由实验室筛选的5种不同酵母菌种及产香酵母和产酒精酵母的复配来发酵生姜梨酒，研究酵母菌种对生姜梨酒品质的影响，通过测定其酒精度、糖度、酸度等理化指标，感官评定、对其香味成分的分析，最终选出适合生姜梨酒发酵的最优酵母及组合，以期酿造出高品质的生姜梨酒，为其发酵加工提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

雪花梨、生姜、白砂糖、土豆，市售；Yeast-W2、Yeast-全兴5#、Yeast-NJSYS-70、异常毕赤酵母(Pichiaanomala)，酿酒生物技术及应用四川省重点实验室提供；安琪果酒酵母，湖北安琪果酒酵母股份有限公司。

1.2 仪器与设备

MJ-25BM05C榨汁机，广东美的精品电器有限公司；WYT-ⅡA手持式糖量计折射仪、7890A-5975B气相色谱质谱联用仪，美国Agilent公司；HT300A固相微萃取仪，意大利HTA公司；XMT-100C恒温培养箱，重庆市永生实验仪器厂；Bioflo310型发酵罐，美国NBS公司。

1.3 试验方法

1.3.1 生姜梨酒生产工艺流程

1.3.2 操作要点

选取雪梨去皮破碎成汁后，加入0.1%的抗坏血酸、0.2%的柠檬酸进行护色处理，加入新鲜老姜片，生姜梨汁质量比1∶30[10]，加90 mg/L偏重亚硫酸钾进行SO2处理，调整糖度到21%，8%的接种量，28 ℃恒温静置培养，发酵时间为8 d，测定酒精度、还原糖、总酯等指标，并进行感官品评评定和GC-MS检测。

1.3.3 试验方法设计

单一酵母发酵实验设计：将Yeast-W2(编号为A)、Yeast-全兴5#(编号为B)、Yeast-NJSYS-70(编号为C)、Pichia anomala(编号为D)、安琪果酒酵母(编号为E)以9%的接种量分别接入发酵液中，待发酵结束后进行感官评定、理化指标测定和风味物质分析。

复合酵母发酵试验设计：以产酒精酵母(B、E)和产香酵母(A、C、D)两两组合进行混菌发酵生产生姜梨酒，以所得梨酒的理化指标和感官评价综合分值作为依据，确定最佳发酵酵母组合。

1.3.4 测定方法

理化指标检测：酒精度、还原糖、总酸参照《葡萄酒、果酒通用分析方法》(GB/T 15038—2006)执行；酒精度以酒精计法测定；总酸以酸碱滴定法测定，以苹果酸计(g/L)；还原糖以直接滴定法测定，以葡萄糖计(g/L)；总酯参照《白酒分析方法》 GBT 10345—2007，以酸碱中和法测定。

感官指标品评：选取10位具有品酒经验的师生，参照GB/T—15038《葡萄酒、果酒通用分析方法》，从外观、香气、口感等方面评价酒样。具体评定标准见表1，最终结果制成感官雷达图。

1.3.5 生姜梨酒风味物质气相色谱-质谱 (GC-MS)检测方法

气相色谱条件：毛细管色谱柱为DB-WAX，规格为60 mm×250 μm×0.25 μm；不分流进样，进样口温度为230 ℃；升温程序：40 ℃保持1 min，然后5 ℃/min升温到180℃，保持1 min，再8 ℃/min升温到230 ℃，保持7 min；载气：99.999% He，流速为1 mL/min。质谱条件：EI电离源，电子能量70 eV，质量扫描范围20～500 u，离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，接口温度230 ℃，溶剂延迟3 min[11]。

定性分析：根据总离子流图检测出挥发性组分的质谱图，通过与标准谱库(NIST05a.L)对比鉴定，匹配度大于75%的予以确认。数据处理：通过GC-MS分析检测得出生姜梨酒风味物质的总离子流图，采用数据分析软件进行谱库检索及相关文献分析，对相应的风味物质成分进行鉴定。

1.4 数据处理

本试验利用 Microsoft Office Excel 2010 软件进行数据的基本处理，用 IBM SPSS Statistics 21.0 分析软件进行方差分析，用 LSD法对数据进行差异性分析(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 不同酵母发酵对生姜梨酒理化指标的影响

2.1.1 不同酵母发酵对生姜梨酒酒精度的影响

比较5株单一酵母及其两两复配后发酵的梨酒酒精度，结果如图1所示。

5株单一酵母复配酒精度范围为7.15%～12.42%vol，其中B和C复配发酵酒精度为7.15%vol，明显低于B、C单菌发酵的酒度(P<0.05)。原因可能是2个酵母生长发酵过程中相互制约，影响彼此酵母生长及后期转化酒精速率。相同糖度情况下，酒精转化率越高，则此酵母的产酒能力越强[12]。由图1可知，B、B与D、E与D或C复配发酵不存在显著性差异(P>0.05)，产酒能力最佳，达12.42%vol，高于其他几个组合。其中E与D复合发酵与其单菌发酵存在显著性差异(P<0.05)，说明E与D复配在产酒精方面为相互促进作用。

2.1.2 不同酵母发酵对生姜梨酒还原糖的影响

比较5株单一酵母及其两两复配后发酵的梨酒的还原糖含量，结果如图2所示。

5株单一酵母还原糖质量浓度范围为0.58～14.98 g/L，发酵基本完成。复配后范围为1～59.4 g/L，其中A和B复合发酵还原糖为48.0 g/L，B和C复合发酵还原糖为59.4 g/L，与其他酒样存在差异性显著(P<0.05),发酵不完全，原因可能是：在相同的发酵时间条件下，A和B、B和C酵母在共发酵过程中为生长竞争性抑制，可能存在B代谢物质影响另一酵母对糖的转化能力，降低糖的利用率，发酵速率较慢。遂在相同发酵时间内，此2种梨酒还未完成发酵，发酵力低于其他酵母。而D、E及D与E复配的还原糖很低，侧面反映相同时间内其酒精转换能力较好。

2.1.3 不同酵母发酵对生姜梨酒总酸的影响

比较5株单一酵母及其复配后发酵的梨酒的总酸含量，结果见图3所示。果酒中适当的酸含量有利于赋予果酒适口性，改善酒体颜色，抑制杂菌，增加酒体稳定性[13]。总酸较低，则酒体柔和、圆润；若总酸量过高，则酒体粗糙、瘦弱。此外，总酸也能影响果酒的颜色和稳定性。由图3可知，5株单一酵母及复配果酒酸度范围为2.370～3.446 g/L。其中E无论是单一发酵还是与C复配，酒样酸度均最高，达到3.446 g/L左右(P>0.05)。结合品酒员对生姜梨酒的尝评结果，D与E的总酸为3.240 g/L为最适酸度，增加酒的爽口性、协调性。本结果与田学梅[10]梨酒的最适酸度4.00 g/L有差异，原因可能是梨酒的糖酸比不同影响了酸的适口性，相同酸度情况下，糖度越低，对酸度的敏感性越强。

2.1.4 不同酵母发酵对生姜梨酒总酯的影响

比较5株单一酵母及其复配后发酵的梨酒的总酯含量，结果见图4所示。

酯类是果酒香气物质的组成成分，其中酵母菌在发酵和陈酿过程中赋予果酒浓郁的酒香，是影响果酒香气特征最关键因素之一[14]。可以通过测定总酯大概判断酒类风味的丰富程度[15-16]。由图4可知，除了E+A组合以外，其他5种复合酵母组合总酯含量有显著性差异(P<0.05)，但相较于单菌发酵，总酯含量均有所提高，酵母复配利于增加果酒风味的丰富性。

2.2 不同酵母发酵对生姜梨酒感官品质的影响

理化分析结果仅视为果酒的感官质量提供参考，果酒实际评价应针对视觉、嗅觉、味觉方面的刺激所形成的总体印象而判断。不同酵母发酵对生姜梨酒品质的影响的感官雷达图见图5所示。综合图5中的外观、香气和口感3个指标得出：单一酵母中，综合感官评价得分最高的是E发酵的生姜梨酒，为84分，其风味口感最佳，果香、酒香突出，有淡淡的生姜清香，酒体丰满，口感醇厚；其次是D为82分，果香、酒香、姜香突出，酸甜适中；B与C酒样的感官评分相差不大，其中A的得分最低，酒体比较单薄。复配酵母中，E+D酒样得分最高为88分，其酒体澄清，色泽浅黄有光泽，口感醇厚，酸甜适中，具有浓郁的梨果香和淡淡的生姜香，典型性比较明确。其品评结果与理化指标测定中体现的菌株的发酵力、降糖能力、总酸最适含量结果基本一致。因此，综合理化分析和感官评价发现安琪果酒酵母与Pichiaanomala组合更适合生姜梨酒的发酵。

2.3 不同酵母对生姜梨酒风味物质的影响

香气成分是果酒优劣的关键因素，本试验对单一酵母发酵和复合酵母发酵的果酒样品进行GC-MS分析，根据色谱的百分比报告和谱库检索报告分析，11种酒样的香味物质对比结果见表2所示。

由表2物质成分结果发现：11种酒样中的挥发性香气物质成分种类大致相似，共测出35种香气物质，分别为醇类10种、酯类12种，萜烯类12种、苯酚类1种。11种酒样中共有物质有7种，分别为苯乙醇、D-香茅醇、辛酸乙酯、乙酸异戊酯、正己酸乙酯、乙酸乙酯、癸酸乙酯等。

2.3.1 醇类物质分析比较

醇类物质共检测出10种(不计乙醇)，主要有异戊醇、异丁醇、苯乙醇等。11种酒样醇类物质种类分别为3、6、2、3、6、6、5、3、4、4、7种，占总含量的11.24%、13.26%、2.91%、21.22%、15.94%、16.03%、12.92%、21.25%、13.76%、16.08%、15.00%，其中共有的醇类为异丁醇、苯乙醇。

注：“-”表示未检出。

醇类主要来自于发酵过程中酵母代谢产生、其次也来源于糖苷类前体和酯类分解等[17]。在11种酒样中，不同酵母发酵结果显示，11种梨酒中异戊醇和苯乙醇含量最多，二者的含量占总醇类(除乙醇外)含量的72.0%～96.5%构成酒体主要香气，与周雪艳等[18]研究发现，梨果酒中检出香气成分中，含量最高的成分为异戊醇、苯乙醇一致。异戊醇，具有水果香和花香，是酵母代谢的产物。苯乙醇具有玫瑰的香气[19]，有一定的杀菌作用，给人以柔和愉悦的感受，显示了异戊醇和苯乙醇是生姜果酒中的主要风味之一。其中B+D酒样中苯乙醇相对含量最高达10.71%，单菌发酵D酒样达6.62%，可能是Pichiaanomala优产苯乙醇。异丁醇具有刺激性的气味，随着浓度的增高对眼睛皮肤、黏膜和上呼吸道的刺激作用越大，安琪果酒酵母产异丁醇相对含量较高。正己醇等醇类也能赋予酒特殊香气，且高级醇也是某些酯类物质的前体物质增加了生姜梨酒后发酵时期形成的酯类种类，对呈香有重要作用，能够提高酒的感官品质。且D酒样和B+D酒样的总醇类物质较多，达21.25%,其酵母适合发酵稍高酒度的果酒。E+D酒样中醇类香气物质种类最为丰富，达7种，且2个酵母复配产生了新的香味物质Α-毕橙茄醇，增加梨酒香味物质成分，为生姜梨酒提供棉厚感。

2.3.2 酯类物质分析比较

酯类物质共检测出12种，主要有辛酸乙酯、正己酸乙酯等。11种酒样酯类物质种类分别为7、7、6、7、6、7、6、9、7、6、10种，占7.61%、7.93%、6.05%、8.70%、9.63%、5.90%、6.27%、10.97%、5.68%、2.70%、4.34%。其中共有的酯类有辛酸乙酯、乙酸异戊酯、正己酸乙酯、乙酸乙酯、葵酸乙酯。

挥发性酯是组成香气化合物的最重要种类，它们赋予葡萄酒和其他发酵饮料主要的水果香气[20]。大多数酯类具有花、果香气，在酵母代谢产生的挥发性物质中，酯对酒的风味贡献最大[21]。酯类主要有辛酸乙酯、正己酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸乙酯等。在11种酒样中，辛酸乙酯相对含量最高，具有白兰地酒的茴香味，与李丽梅等[22]报道辛酸乙酯是梨的特征芳香成分相一致。同时，具有似葡萄酒香和白兰地香气的癸酸乙酯[23]和具有曲香、菠萝香的正己酸乙酯[24]相对含量也很高，使酒闻起来更浓郁；乙酸己酯有梨和猕猴桃香气，有似梨的酸甜味，贡献于生姜梨酒香气的形成。酿酒过程中酯类香气的形成与酵母菌的酯酶或醇酰基转移酶有关，含量最丰富的是乙酸酯，其次是饱和脂肪酸乙酯[25]，而本试验中作为饱和脂肪酸乙酯的辛酸乙酯含量最高，可能与酿酒酵母细胞内的EHT1 和EEB1 基因编码醇酰基转移酶过量表达有关[26-27]。

其中E+D酒样中的酯类香气物质种类最为丰富，达10种。且2个酵母复配产生了新的香味物质乙酸香叶酯(0.08%)和乙酸苯乙酯(0.32%)，乙酸香叶酯清甜而柔和[28]，似有玫瑰、香柠檬、薰衣草的香气，增加生姜梨酒香味物质成分；乙酸苯乙酯，类似苹果、桃子的果香及威士忌样的香韵，适当含量可以缓解苯乙醇给梨酒带来的闷香感。

2.3.3 萜烯类物质分析比较

萜烯类物质主要表现出果实的品种[29]。在11种酒样中，萜烯类物质共检测出12种，主要的化合物有D-香茅醇[30](玫瑰香气)、橙花醇[31](玫瑰香气)。11种酒样萜烯类物质种类分别为5、4、6、7、3、6、8、2、4、7、9种，占2.33%、2.85%、4.74%、3.70%、1.11%、9.52%、7.22%、2.40%、2.99%、2.85%、2.70%，共仅有D-香茅醇，分别占总香气成分的1.56%、1.87%、2.92%、2.68%、0.53%、3.86%、2.82%、2.25%、1.05%、0.96%、1.05%，作为葡萄酒中的特有的香气成分特征，在生姜梨酒中也是一种香气特征，但因为D-香茅醇香气含量不一致而形成各自的风味特点。

A+B组合酒样和A+E组合酒样中2-莰醇(过敏、刺激、可引起头痛等)含量较高，但单一的Yeast-W2发酵并没有2-莰醇产生，可能是酿酒Yeast-W2与产香酵母Yeast-全兴5#、安琪果酒酵母共发酵促进了2-莰醇的生成。11种酒样中，E+D酒样中萜烯类香气物质种类最为丰富，达9种，保留了生姜梨酒的典型性。

2.3.4 物质分析比较结果

从物质含量来看，与其他10个酒样相比，D+E酒样的香味物质最多，为28种，香型丰富，苯乙醇(玫瑰香)、辛酸乙酯(茴香)和异戊醇(微甜)构成酒体的主要香气，辅以正己酸乙酯(菠萝香)，癸酸乙酯(葡萄的水果香气)。综合香气成分分析结果和味觉分析，D+E酒样中生姜梨果酒香气成分复合，各香气物质共同作用增加香气复杂性，达到平衡，赋予优雅和谐的香味，且高级醇含量及成分均多于其他酒样，使果酒更加复杂、浓郁、醇厚，进一步证明了安琪果酒酵母与Pichiaanomala组合更适合生姜梨酒发酵。

2.4 验证试验结果

对比单一酵母发酵实验和复合酵母发酵实验，发现安琪果酒酵母与Pichiaanomala的组合对糖的代谢能力和酒精的转化生成能力最强。验证结果见图6和图7所示。

从图6和图7可以看出，酒精生成的趋势与糖降解的趋势相符，第7天接近发酵结束时的酒精度接近最高值，还原糖含量也基本稳定。发酵的前3 d，总酸含量一直呈上升趋势，但随着发酵继续生成的有机酸被降解，总酸含量逐步降低，第4～6天总酸含量下降缓慢(P>0.05)。原因可能为发酵前期，酵母代谢产生有机酸，总酸含量增加，发酵后期，酵母菌的酒精发酵将有机酸降解为酒精等小分子物质，与张文文等[32]中不同菌种及其混合发酵方式下发酵液的总酸呈现相同的变化趋势，在第2～3天上升至最高，然后缓慢下降。由图6还可以看出，总酯的含量起伏都在前期有些波动，但在后面趋于稳定。

最终发酵得到的生姜梨酒酒精度为12.47%vol，还原糖3.14 g/L，总酸含量3.133 g/L，总酯含量0.442 g/L，结合感官分析结果，得到的酒体清澈透明、有光泽，呈米黄色或浅黄色，口感醇厚，纯正柔和、绵软爽口、爽怡醇厚，具有浓郁的梨果香及淡淡的生姜独特香气，且典型性比较明确。因此，安琪果酒酵母与Pichiaanomala组合能酿造出风味和品质更佳的生姜梨酒。

3 结论

本研究通过对5株酿酒酵母单菌发酵与复合发酵研制的生姜梨酒进行酒精度、还原糖、总酸、总酯等理化指标检测和感官评定，同时采用GC-MS分析比较其风味成分，最终确定安琪果酒酵母与Pichiaanomala为酿制生姜梨酒的最优酵母组合，研制所得生姜梨酒酒精度为12.47%vol，还原糖3.14 g/L，总酸含量3.133 g/L，总酯含量0.442 g/L，GC-MS检测不同酿酒酵母发酵的生姜梨酒中含有35种香味物质，主体香气成分有辛酸乙酯、正己酸乙酯、癸酸乙酯、异戊醇、苯乙醇等，各种香气成分之间的相互协调，赋予了生姜梨酒的独特风味，得到的酒体澄清，色泽浅黄有光泽，果香纯正，口感甜美醇厚，具有浓郁的梨果香和淡淡的生姜香，典型性比较明确。

本文通过不同酵母菌对生姜梨酒发酵和风味的影响研究，确定酿制生姜梨酒的最优组合为Pichiaanomala和安琪果酒酵母，丰富果酒种类，结合研发需求，为新生代果酒-生姜梨酒的开发提供理论依据，以期今后对生姜梨酒的关键技术和瓶颈技术研究攻关，稳步提升新生代果酒发展质量，进一步增强果酒市场的核心竞争力。