深海养殖大黄鱼鱼肉玻璃态转化调控技术

杨巨鹏，张登科，洪梦蓉，张慧恩，吕春霞，杨华*

1(浙江万里学院 生物与环境学院,浙江 宁波，315100) 2(宁波海关技术中心，浙江 宁波，315020)

大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)，属硬骨鱼纲，鲈形目，为传统“四大海产”之一，是我国近海主要经济鱼类[1]。自20世纪70年代以来，由于酷渔滥捕，导致海洋中大黄鱼自然资源衰退，已形不成渔汛；20世纪80年代，大黄鱼人工繁育技术突破后，近海大黄鱼网箱养殖迅速发展，大黄鱼已成为我国规模最大的海水养殖鱼类[2]。海湾传统小网箱高密度养殖条件下，大黄鱼表现出肥满度升高、体色异常、体脂含量增加、肉质松散、风味退化等品质下降现象，不能满足部分消费者对大黄鱼产品品质的需求[3]，所以野生大黄鱼市场价格非常高[4]。目前，为满足消费者对高品质大黄鱼的需求，通过养殖技术和养殖模式的改进，养殖大黄鱼的品质、外观已接近野生大黄鱼[5]，但其市场价格也远高于传统养殖大黄鱼。

深海养殖大黄鱼通常作为生鲜商品流通，客户对其鲜度和色泽等要求很高，其保质期很短，所以在物流过程中需要良好的保障措施来保证产品品质。目前国内仍主要采用低温保鲜技术(即冰温保鲜)，但低温保鲜时间短，而且在保鲜过程中水产品营养流失大，存在口感降低、营养价值损失等问题[6]。因此需要研究新的保鲜技术替代原有的保鲜技术，从而对产品实现更好的品质控制。玻璃态冻藏技术为食品贮藏开辟了一条崭新的、富有巨大潜力的道路[7]。食品处于玻璃态，一切受扩散控制的松弛过程都将被抑制，反应速率极其缓慢甚至不会发生[8]，所以玻璃化保存可以最大限度地保持食品的品质，玻璃态食品也常被认为是稳定的[9]。近几年，食品玻璃化转变在果蔬[10-11]、淀粉类食品[12]、乳制品[13]、冷冻禽畜肉类[14]、糖果类[15]及水产品[16]等食品贮藏方面均有研究报道。

发生玻璃化转变时的温度称为玻璃化转变温度(glass transition temperature,Tg)，它是控制食品质量和稳定性的关键[17]。根据玻璃化转变理论，冷冻食品最适宜的贮藏温度T≤Tg，而当T>Tg时，体系处于橡胶态，分子流动性增加，各种分子扩散运动控制的化学反应加快[18]。而水产品中水分含量较高，其Tg太低，对其进行玻璃态保藏成本较高，水产品中组分较多，其玻璃化转变也十分复杂。一般来说，Tg受食品中糖类相对分子质量大小影响,对纯物质而言，相对分子质量越大，Tg就越高；相对分子质量低时，随着相对分子质量的增加，玻璃化转变温度急剧升高[18],目前国内外也逐渐开展此方面的研究[19]。本文通过研究不同食品添加物对深海养殖大黄鱼Tg的影响，筛选最适的复合配方，提高其Tg，降低其玻璃态保藏成本，为水产品的玻璃化保存技术的研究与应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

深海养殖大黄鱼,宁波市水产市场，体重(500±25)g，体长(30±3)cm，用冰盒运至实验室后进行样品处理；麦芽糊精、低聚异麦芽糖、羧甲基纤维素(CMC)、海藻糖、海藻酸钠、乳酸钠、柠檬酸钠均为BR级,源叶生物有限公司。

PL2002电子分析天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；131EVO差示扫描微量热仪,法国塞塔拉姆；ALPHA2-4冷冻干燥仪，上海实维实验仪器技术有限公司；S-3400N扫描电镜，日本株式会社日立制作所。

1.2 方法

1.2.1 样品处理

深海养殖大黄鱼去鳞、去皮，取背部鱼肉，放置高速组织捣碎机中制为鱼糜。每50 g鱼肉为1组，每组3个平行；称取不同组别的大分子添加剂，按参考文献[20]选取麦芽糊精、低聚异麦芽糖、羧甲基纤维素(CMC)、海藻糖、海藻酸钠、乳酸钠、柠檬酸钠作为添加剂。

麦芽糊精：质量分数3%，6%；低聚异麦芽糖：质量分数3%，6%；羧甲基纤维素(CMC)：质量分数3%，6%；海藻糖：质量分数3%，6%；海藻酸钠：质量分数0.5%，1%；乳酸钠：质量分数0.5%，1%；柠檬酸钠：质量分数0.5%，1%。

鱼糜与添加物混合均匀后真空包装，放置4℃冰箱中平衡渗透3 h。

1.2.2 感官评定方法

将样品放置蒸锅中蒸制20 min，进行感官评定，评价员根据国标GB/T 16291.1—2012[21]和GB/T 16860—1997[22]进行培训，评定的参考标准[23]见表1。为了避免评价小组成员因各自不同嗜好等因素造成对产品的偏见，感官评定时需对样品进行盲标。样品送呈评价员之前置于20 ℃条件下进行评定测试。每次评价由每位评价员单独进行，不互相交流，且在每个样品评价之间用清水漱口，排除上1个样品对下1个样品的影响；并且设置6位评价员，3男3女；以指标得分总和的平均值为感官评分。

1.2.3 冻结点的测定方法

采用差示扫描量热法(differential scanning calorimetry,DSC)测定样品冻结点[24]，称取试样5 mg，放入铝制坩埚并压封，放置仪器样品盘，盖好内盖，装上冷却罐，冷却液为液氮。开始温度-130 ℃，平衡时间3 min，停止温度0 ℃，升温速率10 ℃/min，载气(N2)流速50 mL/min，每个样品重复3次。参照热分析领域确定热效应起点和终点的通常做法，DSC热流曲线由熔融峰上升侧面的拐点处作切线与基线的交点，定为试样的冻结点。

1.2.4Tg的测定方法

采用多次扫描法[25]测定样品Tg，称取试样5 mg，放入铝制坩埚并压封，放置仪器样品盘，盖好内盖，装上冷却罐，冷却液为液氮。降温至-130 ℃，平衡20 min。然后从-130 ℃升温到20 ℃，升温速率10 ℃/min，载气(N2)流速50 mL/min，重复3次。采用DSC软件分析热流密度曲线，得到初始(Tgi)、中点(Tgm)和终点(Tge)的玻璃化转变温度，样品玻璃化转变温度取其中点值Tgm。

1.2.5 扫描电镜样品处理

将样品切成3 mm×3 mm×1 mm的薄片，放入3%的戊二酸溶液在4 ℃温度下固定24 h，倒掉固定液，用0.1 mol/L的磷酸缓冲液漂洗样品3次，每次15 min；用质量分数1%锇酸溶液固定样品1 h，倒掉固定液，用0.1 mol/L磷酸缓冲液漂洗样品3次，每次15 min，依次用体积分数为30%、50%、70%、80%、90%乙醇溶液对样品进行脱水处理[26]，每个浓度处理15 min，再用无水乙醇处理2次，每次10 min，再依次用V(无水乙醇)∶V(叔丁醇)混合液(3∶1、1∶1、1∶3)处理10 min，再用叔丁醇处理样品10 min，加适量叔丁醇，放入-70 ℃冰箱2 h，然后放入冷冻干燥机干燥48 h，样品黏贴，真空离子溅射键白金膜，处理好的样品进行电子显微镜观察，拍摄样品横切面的500倍扫描图像。

1.2.6 Box-Behnken实验设计

根据单因素试验结果进行4因素3水平的Box-Behnken中心组合设计试验。选取Tg作为响应值，优化添加剂配方。

1.2.7 统计分析

试验设 3～5个平行，数据用平均值±标准差表示，使用SPSS Statistics 17软件进行差异性显著分析，其中P<0.05差异显著，P>0.05 差异不显著，使用Office excel 2003软件进行数据处理及绘图；采用DSC软件分析热流密度曲线。

2 结果与分析

2.1 单因素实验与结果

2.1.1 不同添加剂对深海养殖大黄鱼肉感官的影响

根据相关文献[20]并参考《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》(GB 2760—2014)[27]，选取麦芽糊精、低聚异麦芽糖、羧甲基纤维素(CMC)、海藻糖、海藻酸钠、乳酸钠、柠檬酸钠作为添加剂，以感官评价作为测定指标，初步筛选出合适的添加剂。

由图1可得，空白组感官评分最佳(32.25±0.96)且差异性显著，说明添加物本身会影响鱼糜的口感；部分实验组略低于空白组，如3%海藻糖组(30.75±1.25)和3%麦芽糊精组(29.50±1.29)，这2组和空白组相比，感官评定差别不大，仅带有略微的甜度；6%海藻糖组(29.25±0.96)、0.5%乳酸钠组(28.75±1.71)、1%乳酸钠组(28.50±0.58)、6%麦芽糊精(28.00±0.82)、0.5%柠檬酸钠(24.75±0.96)组感官评分都有所下降，不过都尚可接受。其余实验组存在感官评定某项评分过低的问题，如低聚异麦芽糖组存在蛋白变性严重，口感粗糙的问题；CMC组口感难以接受，海藻酸钠组无肉质感，且出现糊化现象，均不适合作为深海养殖大黄鱼肉的添加剂。为了进一步筛选出复合添加剂配方，故选取海藻糖、乳酸钠、麦芽糊精、柠檬酸钠进行下一步试验。

2.1.2 不同浓度添加剂对深海养殖大黄鱼鱼肉冻结点和Tg的影响

食品冻结点是对食品物料进行冻藏、运输、加工、销售中需要了解和控制的参数之一，物料在冻结过程中，存在“最大冰晶生成带”，由于生成大量冰晶，组织受损严重，造成食品品质下降[28]，但如果冷却速度足够快或难以形核，以至于液体来不及成核和长大，即使到了熔点以下也仍然保持高温时的状态，即液体凝固通过另一条途径进入过冷状态，即可生成玻璃体[29]，因此冻结时通过“最大冰晶体生成带”的时间短，则品质会更好。

由图2～图5可知，添加海藻糖、乳酸钠、麦芽糊精、柠檬酸钠均会降低样品的冻结点，且随着添加量的增加，冻结点降低的越多，与空白对照相比，1%乳酸钠降低了2.64 ℃，5%海藻糖降低了3.81 ℃，0.5%柠檬酸钠降低了2.82 ℃，5%麦芽糊精降低了5.04 ℃，可能是因为样品基质浓度变大，冻结点降低，这与康彦[30]的研究结果一致。添加海藻糖、乳酸钠、麦芽糊精、柠檬酸钠均能提高样品Tg值，且随着添加量的增加，Tg值提高的越多；其中添加海藻糖和麦芽糊精对提高样品Tg有较好的作用，5%海藻糖组Tg值提升至(-90.12±0.27)℃。

5%麦芽糊精组提升至(-95.52±0.29)℃，1%乳酸钠提升至(-102.21±0.24)℃，0.5%柠檬酸钠提升至(-100.19±0.43)℃。可能是添加物与水之间或者相邻大分子之间存在相互作用，从而使得分子扩散变弱和减慢，改变物质体系的性状，提高体系的Tg。

2.2 响应面优化添加剂配方

为研究添加物与Tg值之间的关系，优化获得最佳添加物复合配方，根据Box-Benhnken模型的中心组合试验设计原理，在单因素试验的基础上，进行4因素的响应面试验，响应面因素编码及水平见表2，试验结果见表3。

利用方差分析可以得到各个数据之间的显著差异。运用Design-Expert 8.0程序对各试验点的响应值进行最小二乘法拟合回归，得到二次多元回归方程模型为：Tg=-80.35+2.56×A+9.67×B+11.08×C+1.66×D-1.35×A×B+0.74×A×C-4.64×A×D+5.69×B×C+4.97×B×D-4.03×C×D+3.77×A2-6.57×B2-2.52×C2+1.34×D2

对模型进行方差分析，所得结果见表4。

注：模型R2=0.976 3，Radj=0.9526，*P<0.05，**P<0.01

由表4可以看出F模型=41.226 1>F0.01(14,14)=3.698，P模型<0.000 1，表明回归模型极显著性，预测试验结果的误差很小，所得二次回归方程高度显著。此外，由模型R2=0.976 3，Radj=0.952 6可知，模型可以解释97.63%的响应值的变化，模型拟合度高，能较好地描述各影响因素对Tg的影响，从一定意义上证实本试验方法的可靠性。由表4得海藻糖和麦芽糊精(BC)交互作用最为显著(P<0.01)，这与胡庆兰[20]的研究结论相同；其余因素间也存在交互作用，其中乳酸钠和柠檬酸钠(AD)、海藻糖和柠檬酸钠(BD)、麦芽糊精和柠檬酸钠(CD)交互作用均为非常显著(P<0.01)，但乳酸钠和海藻糖(AB)、乳酸钠和麦芽糊精(AC)交互作用均不显著(P>0.05)，各因素间交互作用见图6。

模型计算得到添加剂理论最优组合设计为0.2%乳酸钠、4%海藻糖、4.0%麦芽糊精、0.3%柠檬酸钠；模型方程预测Tg值为-52.61 ℃。为验证响应面法的可行性，采用此配方进行验证实验，采用3次平行试验的Tg实际值为-53.31 ℃，与回归方程所得预测值相对偏差在正常偏差范围内，表明回归方程能较好地反映各因素对深海养殖大黄鱼鱼肉的影响，回归模型较为可靠。由此可知，最佳食品添加剂组合为：0.2%乳酸钠、4.0%海藻糖、4.0%麦芽糊精、0.3%柠檬酸钠。目前国内外此类研究也逐渐开展，如SRITHAM等[31]研究表明加入NaCit可以提高低水分生物玻璃的稳定性。康彦[30]研究表明冻藏罗非鱼的Tg随着抗冻剂添加量的增大而有所升高；SHI等[32]研究表明添加糖类尤其是菊糖与海藻糖能显著提高南美白对虾肉的贮藏稳定性，延长其货架期。

2.3 添加物质对深海养殖大黄鱼鱼肉微观结构的影响

食品添加剂能改善鱼糜制品的微观结构，原因可能是食品添加剂能与相邻的分子紧密的包在一起，形成一种相互作用的结构，使得分子扩散受阻，分子变性和分子运动非常微弱，从而使得食品能够维持原来良好的性状。由图7可得，添加最佳配方添加物的样品扫描电镜图(图7-b)与空白对照组扫描电镜(图7-a)相比，添加组内部结构紧密、均匀、表面平整，无明显空洞，而空白组有较大的空洞，组织比较松散，说明添加物可以与样品蛋白质发生交联作用，使得凝胶更为致密，因此可以改善制品的凝胶强度。表明食品添加剂可能与鱼肉制品中的生物大分子物质(蛋白质、糖、脂肪)等相互作用，提高了鱼肉制品的Tg。

3 结论

实验结果表明，最佳食品添加剂组合为：0.2%乳酸钠，4.0%海藻糖，4.0%麦芽糊精，0.3%柠檬酸钠。可以有效提高样品的Tg，可为后来以超低温冰箱代替传统液氮玻璃态储藏提供理论支持，可以降低其玻璃态保藏的成本，提高普及化。食品是多相、多组分、非均质，而水产品相较于果蔬等食品在物理化学性质方面更不稳定的，通过深入研究玻璃化转变与食品贮藏加工中发生的一系列品质变化机理关系，结合水动力学和玻璃化动力学形成一定的理论基础。将玻璃化转变温度与水分含量和水分活度、黏度等重要的临界参数和现有的技术手段相结合考虑，来实现真正的玻璃化保存，同时找到更好的抗冻剂及制冷剂来降低玻璃态保鲜的成本，方便其在食品保藏领域的推广。