米酸汤在发酵过程中品质变化及发酵动力学研究

王容，赵良忠*，李明 ,4，孙孟京 ，谢春平 ，邓雅欣 ，欧红艳

1(邵阳学院 食品与化学工程学院，湖南 邵阳,422000) 2(豆制品加工技术湖南省应用基础研究基地，湖南 邵阳,422000) 3(湖南省果蔬清洁加工工程技术研究中心，湖南 邵阳,422000) 4(广州佳明食品科技有限公司，广东 广州,510000)

贵州地域天气温润，腹泻、痢疾等疾病比较常见。食酸成为贵州人民特有的饮食习惯，其中以酸汤最为著名，故有“三天不吃酸，走路打串串”之说[1-2]。米酸汤味道清香爽口，沁人肺腑。除富含多种维生素和各类微量元素外，还富含氨基酸、有机酸等。

贵州的米酸汤一直采用自然发酵，周期长、产酸低、产品质量不稳定[3-5]。当前大部分研究仍停留在对酸汤中的微生物进行分离鉴定、酸汤发酵工艺优化、营养特征物质以及一些风味物质分析，忽略了对酸汤动力学的研究[5-7]。虽然现在已有学者以苗族地区农家自酿的酸汤为原料，对其中的乳酸菌进行分离鉴定，研究其生物学特性，建立了单一菌种的发酵动力学模型[8]，但对米酸汤混合乳酸菌发酵动力学的研究鲜有报道。本实验进行了以鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、玉米乳杆菌(L.zeae)、植物乳杆菌(L.plantarum)为混合菌种发酵米酸汤，研究其在发酵过程中品质的变化和发酵动力学。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

从豆清液中分离出3株产酸高的Lactobacillusrhamnosus、L.zeae、L.plantarum,由豆制品加工技术湖南省应用基础研究实验室提供；大米、糯米,市售；液化酶(酶活4 000 u/g)、糖化酶(酶活120 000 u/g),广东溢多利生物科技股份有限公司提供；乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸,均为色谱纯,北京索莱宝科技有限公司提供；其他化学试剂均为分析纯。

SW-CJ-2FD型超净工作台，江苏通净有限公司；UV-1780型紫外可见分光光度计，岛津公司；GI54DWS型全自动灭菌锅、le204e型电子天平，长沙艾迪生物科技有限公司；DH-360型电热恒温培养箱，DZKW-4型电热恒温水浴锅、VELOCITY18R型台式冷冻离心机，澳大利亚达卡米公司；U-3 000高效液相色谱，天津市兰博实验仪器设备有限公司；CR-400色彩色差计，广东七彩仪器设备有限公司；NDJ-5S旋转黏度计、电子鼻和电子舌，上海瑞玢科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 米酸汤发酵(图1)

1.2.1.1 工艺流程

1.2.1.2 操作要点

(1)浸泡：称取m(面粉)∶m(大米)∶m(糯米)=2∶1∶1共100 g，净水洗涤1～2次，在室温25 ℃的恒温培养箱中浸泡约6 h。

(2)糊化：加900 g去离子水进行磨浆，再将磨好的米浆加热到100 ℃并保温5 min。

(3)液化：在温度降为85 ℃时，调pH值到6.5，添加1%(质量分数)的液化酶，液化25 min。

(4)糖化：在温度降为55 ℃时，调pH值到4.0时，添加0.02%(质量分数)的糖化酶，糖化1 h。

(5)灭菌：105 ℃、8 min进行灭菌。

(6)接种：把从实验室进行活化、扩培、驯化的混合菌，按接种量为5%(V/V)接种于待发酵液中。

(7)发酵：摇床转速160 r/min，培养温度36 ℃，每隔6 h取样测其有机酸、蛋白质、黏度、色差、pH值、感官评分、菌体含量、乳酸含量、残糖浓度的指标变化。

1.2.2 总酸含量测

参照国标《GBT 12456—2008食品中总酸的测定》[9]。

1.2.3 菌体含量测定方法

用移液枪吸取10 mL发酵液于12 000 r/min离心5 min，弃上清液，用去离子水洗涤3次后，于105 ℃烘干至恒重，称菌体质量[10-11]。

1.2.4 残糖量测定

按照3,5-二硝基水杨酸法测定[12]。

1.2.5 蛋白质质量分数测定

参照 GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》[13]的凯氏定氮法。

1.2.6 有机酸测定[14]

取米酸汤10 mL，经过滤后在10 000 r/min下离心20 min，取上清液1 mL，经0.22 μm滤膜过滤，超声脱气供分析用。液相色谱条件：色谱柱为CAPECELL PAK MG-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，柱温30 ℃，检测波长210 nm，流动相V(甲醇)∶V(pH=

2.65 0.01 mol/L KH2PO4溶液)=5∶95；流速1.0 mL/min；进样量20 μL。

分别准确称取草酸10 mg、苹果酸10 mg、柠檬酸10 mg、乳酸10 mg。用重蒸水溶解并分别定容到4个10 mL容量瓶中，得到质量浓度为1.0 mg/mL标准酸原液，密封置于4 ℃冰箱中保存待用，按照表1配制混合酸标样。采集数据，根据峰面积与质量浓度的关系建立线性回归方程，见表2和图2。

1.2.7 色差值

用移液枪准确移取混匀的米酸汤2 mL，以蒸溜水为对照，测定米酸汤的L*(亮度)、a*(红绿度，正值为红色,负值为绿色)、b*值(黄蓝度，正值为黄色，负值为蓝色)，然后按照公式(1)求出ΔE值，ΔE越大表示样品颜色差异越大。

(1)

1.2.8 黏度测定

量取20 mL米酸汤，采用NDJ-5S旋转黏度计进行测试。

1.2.9 感官评定

由10名有经验的食品专业评员组成评定小组，分别对米酸汤的色泽、内部形态、滋味和香气进行评定，采用百分制，具体的感官评价标准见表3。

1.2.10 米酸汤发酵动力学模型建立

1.2.10.1 菌体生长动力学方程

在菌体生长动力学模型中，最为常用的是Monod和Logistic模型[15-16]，Monod主要用来描述密度较低和生长较慢的菌体，但混合乳酸菌生长较快，到发酵后期菌体浓度很大，采用Monod方程不合适，所以采用描述生长曲线为S形的Logistic模型。结合参考文献[17-18]，对本实验中不同阶段的混合乳酸菌采用如下方程：模拟菌体生长变化，Logistic 方程[19]；模拟乳酸生成，Luedeking-piret 方程[20]；模拟总糖的消耗，Luedeking-piret 方程[21]。

Logistic方程求积分式见公式(2)：

(2)

式中：CX,菌体生物量,g/L；t,时间；k,微生物的最大比生长速率；Cm,菌体最大生物量,g/L；C0,菌体的初始生物量,g/L。

1.2.10.2 产物生成动力学方程

本实验采用Luedeking-piret方程[22-23]。通用模型方程如公式(3)：

(3)

式中：P,产酸量,g/L；P0,初始乳酸量,g/L；t，时间，h；n1，与菌体量有关的合成系数[g/(g细胞·h)]；n2，与菌体生长有关的合成系数(g/g 细胞)。

1.2.10.3 基质消耗动力学方程

本实验中由于混合乳酸菌的生长和产物生成是部分偶联型，则采用Luedeking-piret方程[24-26]。

(4)

式中：S,底物质量浓度,g/L；S0,初始底物质量浓度,g/L；t,时间,h；r2,底物用于菌体生长的得率系数,g/g；r1,微生物的维持常数，h-1。

1.2.11 电子鼻及电子舌测定风味物质

电子鼻测定:将电子鼻传感器预热0.5 h以上，使其达到工作温度，称取5 mL样品于玻璃进样瓶中，加盖密封待检。待进样瓶中的样品达到液-气两相平衡后，对所需检测的样品数据进行采集，设置采样时间为120 s，气体流量为0.3 L/min，等待时间为10 s，清洗时间为120 s，每个样品重复4次。

电子舌测定:将电子鼻传感器预热0.5 h以上，使其达到工作温度，对电子舌传感器进行完全地清洗，以免影响试验样品数据的采集，清洗溶液为去离子水。清洗完成后，设定测定时所需要的相应参数，量取15 mL待测样品倒入电子舌专用烧杯中，对样品进行检测。采样时间180 s，采样速度为1次/s，每个样品平行测定5次。

1.2.12 数据处理

运用IBM SPSS Statistics 22软件进行数据处理分析，且每组实验重复3次(结果均以平均值±标准差表示)与相关性分析，应用Origin 9进行拟合求解。

2 结果与分析

2.1 米酸汤在发酵过程中有机酸含量变化结果分析

如表4所示，在米酸汤随着发酵时间变化过程中所检测的4种有机酸中，乳酸含量最高，在发酵后期达到了10.360 g/L，酒石酸和苹果酸含量次之，在发酵后期分别达到了0.191、0.194 g/L。柠檬酸有检测出，但在发酵后期含量极少，基本没有。乳酸在0～24 h内随发酵时间增长缓慢，在24～102 h随发酵时间呈直线上升，102 h后随发酵时间基本保持不变。酒石酸的生成曲线基本与乳酸一致，柠檬酸在0～60 h随发酵时间呈直线上升，在60～96 h随发酵时间呈下降趋势，在96 h之后柠檬酸含量基本为0。苹果酸在18 h之前含量基本为0，在18～96 h随发酵时间呈上升趋势，在96 h之后基本保持不变，略有下降趋势。图3为120 h时米酸汤中有机酸色谱图。

注：结果为平均数±标准差。下同。

2.2 米酸汤在发酵过程中感官评分、蛋白质、黏度、色差值和pH值变化结果分析

如表5所示，在米酸汤发酵过程中蛋白质、黏度、pH随发酵时间的变化都呈下降的趋势，色差值和感官评分都呈上升的趋势。蛋白质在0～12 h随发酵时间下降比较缓慢，在12～96 h随发酵时间呈直线下降，在102 h之后，蛋白质基本在0.81 g/100 g左右保持不变。黏度在0～12 h随发酵时间下降缓慢，在12～102 h随发酵时间呈直线下降，在108 h之后，黏度基本在2.7 mPa·s左右，变化非常小。pH值在0～24 h随发酵时间呈直线下降，在24 h之后随发酵时间下降缓慢，在发酵后期基本保持不变。感官评分在0～102 h随发酵时间直线上升，在102 h到达最高,为(90.38±0.16)分，之后便保持不变。

2.3 米酸汤在发酵过程中品质相关性分析

根据表6进行的米酸汤品质指标之间的相关性分析表明：感官评分与乳酸、苹果酸、酒石酸呈极显著正相关关系(r为 0.983、0.914、0.796)，即酸度越高，米酸汤感官评分越高；与色差值呈显著正相关关系(r为 0.979)，即色差值越大，米酸感官评分越高，可能原因是微生物产生的酶将蛋白质降解成氨基酸,糖类降解成单糖,两者发生了Mailard反应，产生了类黑精等物质，使颜色发生变化，影响米酸汤的色泽，从而影响感官评分；感官评分与蛋白质、黏度和pH值呈极显著负相关关系(r分别为-0.983、-0.987、-0.741)。黏度与蛋白质、pH值呈极显著正相关关系(r为 0.989、0.689)；黏度与感官评分、色差值、乳酸、苹果酸、酒石酸呈极显著负相关关系(r为-0.987、-0.953、-0.993、-0.898、-0.713)；一方面可能是混合菌在发酵过程中，未被水解的直链淀粉和支链淀粉的比例发生改变,降解了淀粉中的支链淀粉，另一方面可能是蛋白质大分子在混合乳酸菌的作用下水解成小分子的肽、氨基酸残基等小分子物质，使黏度下降，从而影响米酸汤的内部形态和口感。综上所述，米酸汤在发酵过程中品质指标间有着非常复杂的联系。

注：**在P<0.01上差异极显著。

2.4 米酸汤发酵动力学分析

混合乳酸菌在米酸汤中发酵动力学曲线如图4所示。

混合乳酸菌发酵周期为120 h，混合乳酸菌的生产过程随发酵变化可分为4个阶段。0～8 h为延滞期，菌体增长速度缓慢，总酸合成速度比较低，残糖的消耗速度也比较低；8～48 h后进入对数期，碳源充足，菌体快速生长，呈直线上升，残糖消耗也加快，总酸含量持续增多；48～108 h进入稳定期，菌体繁衍后代的速度逐渐下降，相对菌体死亡数开始渐渐增加，此时菌体繁衍子代的数量与死亡数渐渐达到平衡，米酸汤的pH值低，抑制了菌体生长，残糖消耗基本不变，乳酸合成速度降低，总酸含量基本保持不变；108 h之后菌体含量呈下降模式，进入衰亡期。

2.5 模型拟合求解与检验

2.5.1 发酵动力学拟合求解

利用Origin 9对方程(2式)进行线性拟合，得到的方程为：y=0.175 6x-3.685，相关系数R2=0.991 6。由此可得k=0.175 6，Cm=0.122 4。

利用Origin 9将菌体生长稳定期乳酸含量与时间进行线性拟合，得到方程式为：P=0.097 2t+1.192 5，相关系数R2=0.998 5，由此可得n1=0.019 4。将k=0.175 6，C0=0.122 4 g/L，Cm=5 g/L，n1=0.019 4，P0=0.62，代入方程(3式)并过(0，0)点进行线性拟合，得到方程为y=0.535 9x+0.028 4，相关系数R2=0.996 2，由此可得n2=0.535 9。

利用Origin 9取菌体生长稳定时期，将基质残糖浓度S与时间t进行线性拟合得到：S=-0.044 9t+12.318，相关系数R2=0.881 4，得到r1=0.009。将k=0.175 6，C0=0.122 4 g/L，Cm=5 g/L，r1=0.009，S0=19.15，代入方程(4式)并过(0，0)点进行线性拟合，得到方程为y=1.665 8x+0.416 8，相关系数R2=0.99，由此可得r2=0.166 5(表7)。

将各参数及初始条件值代入模型(2)式、(3)式、(4)式得：

菌体生长动力学模型：

乳酸生成动力学模型：

残糖消耗动力学模型：

S=50.03-1.485×

2.5.2 模型验证

为了进一步验证模型的真实性，用Origin 9得到混合乳酸菌发酵过程的拟合曲线，如图5所示。从图5中可以看出3个模型的模型值与实验值拟合曲线比较理想。模型的相关性均在0.01水平(双侧)显著相关，菌体生长动力学模型Pearson相关性0.998**；乳酸生成动力学模型Pearson相关性0.999**；残糖消耗动力学模型Pearson相关性0.992**。较好地反应了实际的发酵过程，表明了模型对米酸汤发酵过程具有一定的指导意义。

2.6 米酸汤成分测定

混合菌发酵米酸汤(本研究混合菌发酵米酸汤发酵4 d时的样品)、自然发酵米酸汤(不加入混合菌自然发酵的样品)、贵州米酸汤产品(市场上购买的贵州米酸汤产品)各组分含量见表8。混合发酵米酸汤总酸低于贵州米酸汤产品，其有机酸(乳酸、酒石酸)、还原糖均高于自然发酵米酸汤和贵州米酸汤产品。与自然发酵米酸汤对比，混合发酵米酸汤和贵州米酸汤产品中的蛋白质、乳酸含量均有提高，乳酸占总酸的比例分别是95.98%、71.08%、28.86%，可见，混合发酵米酸汤中有机酸含量最多，都是通过发酵生成的有机酸，而贵州米酸汤产品中有机酸(以乳酸计)只占总酸的28.86%，推测可能是后期发酵完调配了一些无机酸。

注：a,b,c代表不同水平之间有显著性差异(P<0.05)。

2.7 风味结果分析

2.7.1 电子鼻

图6为3种米酸汤的主成分分析(principal component analysis，PCA)，由图6可知，第一主成分(PC1)的贡献率为98.6%，第二主成分(PC2)的贡献率为1.1%，二者之和达到99.7%,大于95%，因此可认为此主成分二维图能很好地表示出被测样品的整体信息且成分间干扰小。其区分度(discrimination index，DI)达91.8%，一般情况下认为DI值大于80%区分效果较好，DI值越大表示样品间的距离越远，区分的效果越理想。由此可见，3种不同的米酸汤挥发性风味成分有明显区别。

2.7.2 电子舌

图7表示3种米酸汤的PCA，由图7可知，PC1的贡献率为33.84%，PC2的贡献率为18.51%，二者之和达到63.56%,小于95%，因此可认为此主成分二维图不能很好地表示出被测样品的整体信息且成分间干扰大。其DI达90.27%，由此可见，3种不同的米酸汤的风味成分有明显区别。

3 结论

通过比较研究米酸汤在发酵过程中感官评分、蛋白质、色差值、pH值和有机酸可知，米酸汤品质指标间有着非常复杂的相关性。

在米酸汤发酵过程当中，描绘了混合乳酸菌株菌发酵的菌体生长、产物合成、底物消耗的动力学曲线；并通过Origin 9非线性拟合得出菌体生长、产物合成、底物消耗的动力学模型；通过比较菌体生长、乳酸合成和总糖消耗模型的实验值与预测值，结果表明以上模型能够较好地反映发酵情况，对后续的放大试验有一定的指导意义。

通过比较混合菌发酵米酸汤、自然发酵米酸汤和贵州米酸汤产品的组分发现，混合菌发酵米酸汤的乳酸、酒石酸、总酸、蛋白质、还原糖均高于自然发酵米酸汤，总酸低于贵州米酸汤产品，但(乳酸∶总酸)高于贵州米酸汤产品。电子鼻、电子舌可有效区分不同米酸汤产品的风味特征，作为米酸汤风味分析的一种手段。