食品微生物检验技术研究进展

高翔，崔亚宁

（陕西省食品药品监督检验研究院，陕西西安 710065）

随着社会各界对食品卫生的高度关注，研究食品微生物检验技术已成为必然趋势。通过微生物检验能够为食品的安全性提供更为有利的科学证据，同时还能对食品加工环境进行预测，并对食品是否被微生物污染及污染程度进行正确评价。一直以来，食品微生物检测都秉承“预防为主，防治结合”的原则，在很大程度上避免了人畜共病、食物中毒等食品安全事故发生。同时，食品微生物检验还能对食品生产企业产生约束力、威慑力，促使企业能够重视产品质量，极大地保障了食品安全，具有重大意义。

1 食品微生物检验技术现状

一直以来，食品微生物检验采用的是传统的检验方法，如增菌培养、分离纯化、血清鉴定等，这些方法准确率较高，但是操作流程烦琐、检验周期长，制约了检测效率的提升。增菌培养、分离纯化、生化鉴定等操作所需的培养时间一般在1 d以上；平板分离的挑菌落操作，则要求操作人员必须具备工作经验；完成一个对象菌的鉴定，通常需要进行多次生化实验[1]。2003年以前，我国所发布的食品微生物检验标准几乎涉及的都是上述传统的检验技术。2008年发布的检验国家标准中引入了一些新的检验技术，而直至最近几年，才引入PCR检验方法、基因芯片检验法等。

2 食品微生物检验技术的新进展

2.1 利用免疫技术检测微生物含量

利用免疫技术对食品中微生物的含量进行检测，具有高效、快捷等特点，当免疫物质与所针对的微生物或病毒接触时，能够迅速产生反应，整个检验过程耗时较短，通常几分钟即可完成，最长也只需耗时几小时，且免疫反应具有较强的针对性，检测结果的可信度也很高。当前，在食品微生物检验中免疫技术检测应用较广的是乳胶凝集反应，即将乳胶中较大的空隙作为抗原抗体发生特异性结合的场所，以此来对食品中的微生物进行检测[2]。乳胶凝集反应多用于食品中金黄色葡萄球菌的检验；而酶联免疫法则通过免疫反应的不同顺序来判断食品中的微生物种类，多用于大肠杆菌0157、李斯特菌、沙门氏菌等危险微生物的检测。

2.2 可视化基因芯片技术

基因芯片具有较高的灵敏度，近年来在致病微生物检验中应用非常广泛。以往常规的基因芯片杂交反应结束后，无法直接进行结果分析，还需要借助荧光扫描显微镜，因此操作比较烦琐。为有效解决检验结果分析的问题，可视化基因芯片技术随之产生。Ostroff等[3]学者通过大量研究证实，在催化作用下，酶将在芯片表面沉淀下来，从而使得芯片的厚度发生改变，反射到芯片上光的波长随之改变，实验结果只需要根据基因芯片上的颜色变化进行分析即可。可视化基因芯片技术耗时短、操作便捷、检测效率较高，能够一次性对多种潜在微生物进行检出，但是该技术应用成本较高，对操作要求较高，因此在食品微生物检测领域还没有大范围推广。

2.3 荧光标记噬菌体技术

荧光标记噬菌体技术的原理是选用相应的染色剂对噬菌体核酸进行标记，再用标记后的噬菌体对相应的宿主菌进行特异性侵染，当噬菌体在宿主菌的表面吸附后，立刻在宿主细胞中注入标记过的核酸，随着所标记核酸注入量的增加，宿主菌细胞中的荧光素随之增多，通过荧光显微镜就能判定是否存在宿主菌，以此来完成病原菌的检测[4]。Mosier-boss等[5]基于前人研究的基础上，将荧光染料YOYO-1更换为SYBRgold核酸染料，凭借着SYBRgold的高灵敏度特点，在不破坏噬菌体结构和性能的情况下，对沙门氏菌噬菌体P22进行标记，成功检出沙门氏菌LT2株，通过进行染料对比，结果显示SYBRgold核酸染料的实验室检测效果最佳。PheaMH等[6]与FlajshansM等[7]分别在大肠杆菌、沙门氏菌和李斯特菌的检测中，选用SYBRgreenⅠ和SYBRgreenⅡ染料，均成功检测出微生物。该方法具有较强的特异性，且灵敏度高，可在食品微生物实际检测中应用。通常情况下，噬菌体与宿主呈现出一一对应的关系，但是由于宿主范围不广，且两者之间的作用机制并不明确，需要进一步深入研究，因此该技术还没有被广泛应用。但是荧光标记噬菌体技术的检测周期较短，通常几个小时即可完成，还能够同时对多个细菌进行检测，精准区分出死活细菌，在检测前不需要再进行细菌纯化，预增菌后可以立刻进行检测，因此在食品微生物检测中具有广阔的应用前景。

2.4 微滴数字PCR技术

微滴式数字PCR技术简称ddPCR技术，在扩增菌前，通过微滴化技术对一个相对比较大的反应体系进行处理，同时借助油包水技术，将反应体系分割成成千上万个纳升级微滴，每个微滴中不含或至少含有一个待检测的核酸靶分子，且每个微滴都形成独立的PCR反应体系。通过泊松分布原理，根据阳性微滴的个数和比例，可以获得靶分子的起始拷贝数，从而能够对最初反应体系中的核酸靶分子数量进行定量处理[8]。ddPCR技术在分割含有核酸分子的反应体系时，需要在PCR扩增前进行，通过PCR扩增和荧光信号的积累，对阳性反应的单元数进行读取，从而将样本中DNA分子数目计算出来[9]。该技术对反应扩增效率的要求并不高，在很多稀有变异检测中也能够有效应用。与传统的PCR技术相比，ddPCR是一种全新的定量核酸分子的方式，其结果精确度更高、准确性更强、灵敏度更佳，能够实现绝对定量。该项技术在多个领域已经表现出明显的技术优势，如微生物检测、动物疫病检测、地沟油检测等。而随着微滴数字PCR仪的广泛普及，在今后生命科学的各个领域中，ddPCR技术应用将更加广泛。

2.5 代谢学检测技术

代谢学检测技术是微生物检测领域所产生的新兴检测技术，主要是对微生物的繁殖过程进行检测，通过培养基可以明确获取食品中微生物的含量，并开展量化分析。当前，常见的代谢学检测技术主要有电阻抗法、放射测量法以及微量生化法等，均能检测出食品中霉菌和细菌的总量。此外，通过微量生化检验技术，借助试剂的颜色就可以对食品中具体含有细菌的种类进行精准判断，不仅提高了微生物检测的精确度，也推动了我国食品安全管理工作的系统化、规范化发展。

3 结论与展望

立足分子学角度，食品微生物检测技术的发展实现了质的飞跃，从以往传统的培养基培养法，逐渐向PCR技术、荧光定量PCR技术发展，使得食品微生物检测从定性分析转变为定量分析。而近年来，微滴式数字PCR技术的产生，是一种绝对的定量分析检测技术，在PCR扩增前，就有效分割了含有核酸分子的反应体系，提高了检测的灵敏度和精准性。ddPCR技术与传统的PCR技术相比，定量检测限更低，且具有较强的特异性和重复性。此外，通过微滴式数字PCR技术能最大限度地对反应体系进行分散，从而起到消除抑制因子的作用，使得检测过程中的扩增效得到充分保障，对于核酸含量比较低的目标样品，也能够进行有效检测[10]。因此，在今后的食品微生物检测技术的研究过程中，可以将ddPCR技术与EMA-PCR结合起来进行微生物检测，充分发挥出绝对定量检测的优势，使其在日常微生物检测中广泛应用。与常规PCR检测技术相比，在进行相同数量的样品检测时，采用ddPCR技术联合EMA-PCR技术，能够在较短时间内完成检测，且检测结果精确度高，能够真正实现绝对定量。