T细胞及其表位在食物过敏中的研究进展

李 欣， 马 鑫， 谭宏凯， 杨 帆， 陈红兵， 武 涌

（1.食品科学与技术国家重点实验室，南昌大学，江西 南昌330047；2.南昌大学 食品学院，江西 南昌330047；3.南昌大学 中德联合研究院，江西 南昌330047）

食物过敏，是机体对某一给定食物可重复发生的不良免疫反应。它不同于食物不耐受、药物反应和毒素反应，会引发一系列轻微或严重的临床症状。据报道，发达国家和发展中国家食物过敏患者人数每年都在增加[1-3]。我国小范围调查表明，居民食物过敏的发生率在3.4%～5.0%[4]。过敏反应引起的症状累及皮肤、胃肠道、呼吸道等器官，严重的可使人休克甚至死亡。

过敏食物中的蛋白质是引起绝大部分食物过敏的“罪魁祸首”。食物蛋白质经胃肠道消化后，消化肽段被抗原提呈细胞摄取、加工，并与主要组织相容性复合体（MHC）分子一起递呈给初始T淋巴细胞（Th0），然后Th0细胞增殖分化为辅助性细胞（Th），产生相应的细胞因子，刺激B淋巴细胞发生抗体转换，产生IgE抗体，从而引发超敏反应。T淋巴细胞辅助B细胞发生抗体转换处于食物过敏反应的致敏阶段，决定超敏反应的发展。

1 T细胞在食物过敏中的角色

1.1 T细胞的分类

T淋 巴 细 胞 （T lymphocyte）来 源 于 胸 腺（Thymus），T细胞在胸腺中发育成熟分化为不同功能亚群的T细胞，介导机体产生适应性细胞免疫应答，并且辅助抗原诱导体液免疫应答。成熟T细胞只表达CD4或CD8，分为CD4+T细胞和CD8+T细胞；根据功能的不同，T细胞又可分为辅助性T细胞（Th）、细胞毒性T细胞（CTL）和调节性T细胞（Treg），这些细胞实际是初始CD4+T细胞和初始CD8+T细胞活化后分化成不同的效应细胞。前者常涉及适应性免疫应答，后者则涉及固有免疫应答。

CD4+T细胞在适应性免疫应答中至关重要，通过长期的研究发现，CD4+T细胞除了辅助B细胞和CD8+T细胞外[5-6]，还能通过分泌多种细胞因子来抑制病毒的复制或招募其他免疫细胞来清除病原体，并能增强固有免疫[7]。抗原递呈细胞，如树突状细胞（DC），在皮肤或者肠道摄取并加工抗原肽，使MHCⅡ分子与抗原肽结合，进而刺激DC细胞发育成熟并迁移至引流淋巴结提呈给Th0细胞，使其分化成至少6种类型的T辅助细胞—Th1、Th2、Th9、Th17、Th22和诱导型调节T细胞（Treg）等。DC和周围细胞的共刺激分子以及细胞因子的表达决定了Th细胞的分化。白细胞介素（IL）-12和IFN-γ可诱导产生Th1的分化，IL-4和IL-2诱导产生Th2的分化，而Th17和Treg细胞分化发育所必需的细胞因子是TGF-β，Th17的分化还需要IL-6、IL-21和IL-23的参与。IL-4可阻断由TGF-β诱导的Foxp3+Treg细胞的产生，但能与TGF-β协同诱导Th2细胞转分化为Th9[8-9]。Th细胞通过分泌细胞因子来直接或者间接调节B淋巴细胞，促进其分泌IgE或者促使免疫球蛋白发生类别转换，进而诱发过敏反应的发生。

CD8+T细胞通常是指细胞毒性T细胞，它能够特异性识别内源性抗原肽-MHCⅠ类分子复合物，进而杀伤细胞内寄生病原体感染的细胞或肿瘤细胞，其杀伤机制主要有分泌穿孔素和颗粒酶直接杀伤靶细胞，通过Fas/FasL途径诱导细胞凋亡以及产生细胞毒性细胞因子（TNF-α等）。Srivastava等[10]在研究中国药草对延缓花生过敏反应，诱导耐受的影响中，发现IFN-γ型CD8+T细胞与过敏症状减轻的关系。同时也有发现在小鼠模型中，CD8+T细胞减轻了食物过敏原引发的腹泻[11]。CD8+T细胞可能有抑制食物过敏反应的作用，但其机制不详。

1.2 分化后的T细胞与食物过敏反应

CD4+T细胞对过敏反应的发生有至关重要的作用，目前发现有以下几种分化后的T细胞亚群跟食物过敏有密切关系。

1.2.1 Th1/Th2下调引发IgE介导的食物过敏反应大多数食物过敏反应是由IgE介导的超敏反应。引发IgE介导的超敏反应的关键是B细胞中IgE类抗体转换，这个过程主要由Th2细胞分泌的IL-4和IL-13诱发产生。另外IL-5、IL-9、IL-17A、IL-25[12]以及IL-33[13]也被认为跟IgE介导的超敏反应密切相关[14]。从1986年以来，Th1/Th2在体内的失衡（降低）被认为是触发如食物过敏等超敏反应的诱因，但随着对过敏机制的深入研究，一些非Th1或Th2细胞或效应细胞因子过敏反应的发现，让人们发现了过敏反应的发生机制不仅局限于此。

Th9因能分泌Th2型细胞因子（IL-4，IL-5和IL-13）受到关注[15]，其主要分泌的IL-9在小鼠模型和人体的研究中均有促进Th2型免疫反应的作用。Forbes等[16]在IL-9-/-和WT小鼠模型对比中发现抗原特异性IgE、IL-4、IL-5和IL-13表达水平的下降与减弱的Th2反应无关，作者还发现IL-9是肠道肥大细胞增多的诱因。在花生过敏儿童中，Th2与Th9相关的基因表达增多，且IL-9的水平可以作为区分花生过敏（allergy）患者和致敏（sensitization）患者的指示，表明Th9细胞可能参与花生特异性反应[17]。

1.2.2 Th17细胞参与食物过敏反应Th17细胞在2000年被Infante-Duarte团队发现[18]，其通过STAT3激活并分泌IL-17（A-F）等细胞因子参与免疫应答，有研究称Th17通过分泌IL-8或者激活肥大细胞来募集中性粒细胞[19]。Th17首先被发现在延缓超敏反应发展以及关节炎中的作用[20-21]，随后有研究发现在OVA过敏模型中过敏组脾细胞IL-17比治疗组分泌增多[22]。Archila等[23]观察到在腰果过敏患者中，过敏原刺激T细胞试验时，T细胞存在向Th2型细胞的分化的现象，同时存在的大量Th17细胞，说明既有Th2型又存在Th2/Th17极化。另外在花生Ara h1过敏人体中还发现IL-10、IFN-γ和IL-17的表达上调[24]，表明Th17细胞参与了食物过敏反应。

1.2.3 Tfh辅助IgE类别转换Tfh能调节食物过敏反应。另外，Tfh细胞因其分泌IL-21和IL-4能特异性诱导B细胞分化为浆细胞以及免疫球蛋白类别转换中的重要作用而被广泛关注[25]。通过趋化因子受体CXCR5转运到B细胞卵泡，辅助B细胞由IgM抗体转化为IgE抗体。因此，Tfh细胞在调节食物过敏反应方面可能是最关键的一类T细胞亚群。不仅Tfh会产生IL-21、IFN-γ、IL-4、IL-17及Th17细胞，部分Th1细胞也可产生IL-21[26]，Tfh在IgE类别转换中的贡献还有待进一步研究。

1.2.4 iTreg诱导食物蛋白免疫耐受Treg通过分泌IL-10、IL-35和TGF-β参与免疫负调节，其中表达Foxp3的iTreg与维持肠道黏膜免疫耐受有关。Karlsson MR等[27]发现对牛奶耐受的儿童有更高的CD4+、CD25+T细胞频率并能降低外周血单核细胞（PBMC）中牛β-乳球蛋白的体外增殖反应，这表明对食物抗原的黏膜耐受性的诱导与CD4+、CD25+Treg细胞的分化有关。虽然研究表明iTreg细胞对产生耐受有关键作用，但还需要深入探讨诱导耐受的免疫途径（口服、皮下、舌下）的效果和安全性。

不同T淋巴细胞亚群以不同的机制参与过敏反应的发生，与细胞因子等有密切关系。IgE介导的食物过敏反应不再是单纯的Th1/Th2失衡所引起的，还有其他T淋巴细胞的参与。

2 T细胞表位及其研究进展

表位又称抗原决定簇，是指存在于抗原分子中能够诱导免疫反应，一般由5～7个氨基酸残基组成的特殊序列及其空间结构[28]。T细胞表位属于线性表位，没有构象结构域，它们不能与细胞结合的IgE交联或激活炎症性肥大细胞和嗜碱性粒细胞，但能引发T细胞产生增殖、分化，是决定过敏反应的关键，从而使机体的Th1/Th2发生移动。因此，获得T细胞表位信息是充分了解食物过敏致敏机理的物质基础。

2.1 T细胞表位的预测

T细胞表位预测分为CTL表位预测和Th表位预测，即MHCⅠ类分子和MHCⅡ类分子亲和肽的预测。预测方法大体分为两类：基于序列信息和基于结构信息，也有两者相结合的预测方法。由于MHC分子结合肽的氨基酸序列具有一定的特异性和保守性，因此最早、最简单、现在比较成熟的预测方法是直接统计序列信息，再根据统计出氨基酸出现频率等特征建立抗原表位序列模体，如NetMHC（Ⅱ）/pan，SYFPEITHI，UniProt，IEDB等在线网站。

Ravkov等[29]使用REVEAL-MHC结合肽方法测定了原肌球蛋白91段重叠肽，其中包括与17种HLA分子结合力强的肽段，再与IEDB比对相结合的预测方式推测出与MHCⅡ类分子强结合肽。Pascal等[30]使用NetMHCⅡpan-2.0和NetMHCⅡ-2.2算法预测Ara h2肽段与MHCⅡ分子（HLADRB1*，HLA-DQB1*）结合力强的区域，最终鉴定了Ara h2中的4个主要T细胞免疫显性区域。该团队在2016年[31]采用同样的预测算法和试验验证预测了Ara h1中的36个主要免疫显性区域，为花生特异性T细胞表位肽疫苗的研究提供了依据。过敏原T细胞表位的预测受限于肽段长度和锚定残基。其中MHCⅠ类分子比MHCⅡ类分子具有更明显的锚定基，所以MHCⅠ类分子表位预测更简单、准确。MHC分子的多样性使预测出的结果不能完全体现出体内的实际特异性结合情况，因此表位肽一定具有强结合MHC分子的能力，但与MHC结合能力好的肽段不一定是表位肽。

2.2 T细胞表位的定位

T细胞表位是可以刺激T细胞使其增殖分化的片段，所以研究某种蛋白T细胞表位的工具之一是合成的覆盖整个变应原序列的嵌套重叠肽组，将这些肽段分别刺激蛋白特异性T细胞系（TCL）或T细胞克隆（TCC）。由于MHCⅡ类分子识别的T细胞表位很短，所以肽段重组或合成时其长度控制在12～20个氨基酸为宜[28]。肽段的合成可以是覆盖整个蛋白序列的重叠肽，但涉及成本和非必要的问题，也有结合研究经验和热点选择候选表位区。如Tanabe等[32]将牛和人血清白蛋白差异较大区域的16个肽作为候选表位，发现其中有3个肽段可以诱导T细胞增殖，并且这3个区域也可被B细胞识别。Gouw等[33]认为β-乳球蛋白肽段中AA31-48是可能引起T细胞免疫反应的区域，合成相应肽段后与树突状细胞及T细胞共同孵育，找到了2段免疫显性区。Elsayed等[34]比较了溴化裂解肽和固相合成肽的方法获得αs1-酪蛋白的肽段，确定了αs1-酪蛋白的7个表位序列，并提出小于6个氨基酸的肽段是不被T细胞识别的。肽段设计需要考虑全面性和特异性。为了确保不会遗失可能的表位，每一段肽段至少重复前一段肽段的3～10个氨基酸[35]。经肽段刺激的蛋白特异性T细胞通过一系列免疫测定的方法来检测其增殖及分化情况，从而确定出T细胞表位，测定方法包括流式细胞术，酶联免疫斑点技术（Elispot），荧光染料缀合的HLAⅡ类肽四聚体等。

流式细胞术中，标记羧基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺酯（CFSE）法对肽段刺激T细胞的检测灵敏度高，特别是与其他标记如CD25组合时，但CFSE染色的CD4+T细胞并非全是抗原特异性T细胞，这些非特异性T细胞的增殖可能会降低CFSE的特异性[36-37]。Eugene等[38]将91段包含原肌球蛋白的重叠肽刺激特异性T细胞，CFSE法测定T细胞增殖情况，最终鉴定出17个受DRB1分子限制的T细胞免疫显性表位，其中包含Wang等鉴定出的肽段区域[39]，并且有2个肽段（AA196-210，AA220-235）可以结合多个MHCⅡ类分子。CFSE法测定T细胞增殖的关键在于保证待测定增殖的细胞都被CFSE标记上，某种抗原特异性T细胞占总T细胞的比例很少，在测定所有CFSE标记-T细胞增殖情况时也会记录非特异性增殖。

HLA-肽四聚体复合物比CFSE法具有更高的特异性。Jonathan等[40]运用HLAⅡ类肽四聚体方法鉴 定 出Ara h1受DR0101、DR0301、DR0401、DR0404、DR1101、DR1401、DR1502和DRB5限 制的20个T细胞免疫显性表位。William等[41]研究了Fel d1蛋白HLA限制的T细胞表位，观察到Fel d1特异性T细胞高表达CCR7，共鉴定出6个HLADR限制的T细胞表位，肽段长度在10～20个氨基酸之间。Renand等[42]研究了Pen m1和Pen m2受HLA分子限制的CD4+T细胞表位所在的区域，鉴定出Pen m1 AA 9-28以及Pen m2 AA 281-100是受DRB1*03：01限 制 的T细 胞 表 位；Pen m1 AA 161-180以及Pen m2 AA 193-212是受DRB5*01：01限制的T细胞 表位；Pen m1 AA 197-116以 及Pen m2 AA 265-284分 别 是 受DQA*01：02，DQB*06：02限制的T细胞表位。HLAⅡ类分子识别肽段的方式缺乏灵敏性，肽段往前或往后一个氨基酸都可能会造成不一样的结果，再加上合成昂贵、不易制作，并且许多HLAⅡ类分子不容易被分离用于制作四聚体，因此限制了其应用。

基于Elispot的方法可用于T细胞表位肽的高通量筛选，单个细胞的分泌都会被检测到。Prickett等[43]运用T细胞增殖试验与Elispot技术鉴定出Ara h2的5个T细胞显性表位（AA 32-44，AA 37-47，AA 91-102，AA 95-107和AA 128-141），其中AA 90-141与Nina King等[44]鉴定出的区域相似。Oseroff等[45]鉴定了提摩西草（Timothy grass）的43个抗原区域的T细胞表位分子决定簇，其中有9个肽段区能被超过51%人血清样特异性识别，并发现Phl p特异性IgE水平和T细胞反应之间存在很小或没有相关性。Jason等[46]运用Elispot技术鉴定了小麦、大麦和黑麦蛋白的T细胞表位，得到了相似的致敏肽段，说明致病性乳糜泄T细胞表现出有限多样性。

除了肽段单独刺激特异性T细胞外，研究者还多用其他免疫细胞株来辅助判断肽段的致敏性。如Gouw等[33]合成肽段与树突状细胞和T细胞共孵育得到β-乳球蛋白的免疫显性区域。Nina King等[44]比较了未修饰Ara h2蛋白与修饰Ara h2蛋白的IgE结合能力和RBL-2H3细胞释放介质的能力，并鉴定出了3个T细胞免疫显性表位：AA 11-35，AA 86-125和AA 121-155。再者，Prickett团队[47]基于TCL和嗜碱性粒细胞激活试验鉴定了Ara h1的10个受HLAⅡ类分子限制的T细胞免疫显性表位，主要集中在AA 400-470区域。

2.3 T细胞表位在食物过敏中的应用

2.3.1 预防T细胞表位肽作为疫苗施用具有安全、有效、稳定等优点，T细胞表位肽疫苗分为交叉血清型预防性疫苗和治疗性疫苗，治疗性疫苗包括肿瘤抗原疫苗和微生物抗原疫苗。目前，还没有一项T细胞表位肽疫苗方案通过美国FDA的认证，虽然已有在临床试验中达到好的预期[51]。

基于T细胞表位肽的疫苗在1985年由Jackob等创建的，其是利用外部重组微生物（大肠杆菌）蛋白表达的T细胞表位肽[52]，此外还有T细胞表位合成、利用表达T细胞表位的嵌合病毒、酶处理的抗体表达外援T细胞表位等方式制备T细胞表位肽。成功制备表位肽疫苗的重要组成还有佐剂和载体，佐剂能靶向APC，每种佐剂有不同的优缺点；载体能使疫苗处于适当的大小范围以模拟病毒颗粒而被免疫系统摄取，包括金纳米颗粒、脂质体和病毒样颗粒等，前两种可以很容易通过化学方法与肽和分子佐剂结合，而病毒样颗粒需要在特定的动物细胞培养系统中获得，但其获得的佐剂效益更高[53]。表位肽疫苗制备的前提是表位的预测和鉴定，Pascal等[29-30]团队使用NetMHCⅡpan-2.0和NetMHCⅡ-2.2算法预测Ara h1和Ara h2与MHCⅡ结合的肽，鉴定出40个主要区域，为花生特异性T细胞表位肽疫苗的研究提供了依据。除了T细胞表位鉴别方法外，还有很多已在动物试验中成功的疫苗案例报道，随着免疫信息学的发展，T细胞表位肽疫苗的问世指日可待。

2.3.2 治疗 避免过敏原和施用急救药物如抗组胺药或肾上腺素是现在应对食物过敏的方法。目前，所有食物过敏的治疗方法由于其不安全性还没有一项通过美国FDA的认证。1911年，Noon率先提出过敏原免疫治疗（AIT）可以治疗花粉过敏症[54]。现在已证明采用变应原提取物可以作为缓解过敏性疾病的治疗方法，但存在不可预见的严重不良反应的风险[55-57]。

过敏反应中CD4+T细胞的重要性得到证实，T细胞表位和B细胞表位之间的明显差异有助于开发精准治疗剂以诱导耐受。T细胞表位属于线性表位，没有构象结构域，其不能与IgE交联或激活炎症性肥大细胞和嗜碱性粒细胞，所以施用T细胞表位肽可以诱导耐受而不引起过敏反应。目前T细胞表位肽治疗建议在12～20个氨基酸长度[37]。Takagi等[58]运用转基因技术将日本雪松花粉和大豆球蛋白T细胞显性蛋白融合表达在水稻种子上，喂养Balb/c小鼠，结果显示诱导了小鼠产生免疫耐受。Karen等[59]利用C57BL/6小鼠模型探索了卵白蛋白诱导的过敏性气管炎中静脉注射使用AA 323-339免疫治疗的效果，发现单独使用AA 323-339肽并不能降低炎症的程度，在与另一显性T细胞表位肽AA 263-278混合使用时可减少IL-5和IL-13的含量，但卵清蛋白特异性IgE中的嗜酸性粒细胞增多。Yang等[60]运用鸡蛋卵白蛋白3段免疫显性T细胞表位，在Balb/c小鼠模型中评估基于肽免疫治疗的潜力，结果显示接受多个表位肽的小鼠有更低的过敏评分。Wai等[61]用贝类过敏原蛋白Met e1免疫显性T细胞表位在小鼠模型中得到了相似的结果。Thang等[35]用β-乳球蛋白的2个T细胞表位灌胃致敏的Balb/c小鼠，观察到小鼠过敏临床症状虽有所减轻，但并未诱导产生CD25+、Foxp3+Treg，还需要进一步探讨调节性T细胞介导的免疫耐受以及其他免疫细胞群体的变化。T细胞表位肽疗法依赖于相关过敏原中免疫显性CD4+T细胞表位的鉴定，在一系列的动物模型中证实了T细胞表位诱导成功产生耐受的可能，也有消息称花生过敏原免疫疗法进入了临床Ⅲ期，相信在不久的将来食物过敏有“药”可治。

3 结语

食物过敏是一种免疫反应，作为细胞免疫的核心细胞T细胞，既在致敏阶段起到协助提呈的作用，又在效应阶段促进特异性抗体生成。由于T细胞可分化为不同的亚群，以不同的角色来参与过敏反应。因此T细胞是食物过敏的关键细胞。虽然有部分研究成果，但仍有许多未解之谜。结合过敏原的特性，探讨T细胞表位肽也是探索食物过敏的重要方向。所以，对过敏原中免疫显性CD4+T细胞表位的鉴定不仅可以探究过敏反应发生机制，还能找到预防和治疗过敏反应的理论基础。