根管封闭剂对粪肠球菌抗菌作用的研究进展

刘 瑾，程小刚，仇 珺，梅笑寒，程 庚，白 玉，余 擎

牙髓病和根尖周病是最常见的口腔疾病之一，可以造成患者的极度不适感、颌面部疼痛和牙齿缺失等危害；还能影响患者的身心健康并降低患者的生活质量[1]。此外，牙髓和根尖周病还有可能成为系统性疾病(如细菌性心内膜炎和心血管疾病)的感染源[2]。大量研究报道，细菌及其代谢产物是牙髓病和根尖周病的主要病因之一[3]。目前，根管治疗术是治疗牙髓病和根尖周病应用最广和效果最好的方法，其根本性目的是清除根管内感染并对根管进行彻底的消毒，继而对根管系统进行三维严密的充填，最终促进根尖周组织的愈合[4]。然而，初次根管治疗的成功率为86%～98%[5]。根管治疗失败的主要原因是根管系统内感染的持续存在，粪肠球菌是最主要致病菌之一[6]，而当前临床所用根管机械-化学消毒和封药技术很难将其彻底清除[7-8]。研究证实粪肠球菌可以通过自身变异或者从其他细菌获得耐药基因从而对根管内常规用药产生耐药性[9]。此外，它还可以在根管内形成细菌生物膜。有学者研究证实粪肠球菌及其生物膜可以耐受经过治疗根管内包括“寡营养”和“高pH值”等在内的“恶劣”环境[10-11]。一旦环境适宜，其便有可能引起根管再感染和治疗失败的发生。根管充填是用生物惰性材料(如牙胶尖)和根管封闭剂对根管系统进行三维、严密的充填[12]。牙胶尖是一种生物惰性材料，主要用来填充根管腔。根管封闭剂的主要作用是填充牙胶尖和根管壁之间的空隙、封闭根管系统、充填根管系统中不规则区域和埋没杀死根管内残存细菌[13]。作为根管治疗的最后一个步骤，根管封闭剂将长期存在于根管内。如果根管封闭剂具备长期稳定的抗菌作用，尤其针对粪肠球菌，那么无疑会增加根管治疗的成功率并维持其长期疗效。当前，根管封闭剂种类繁多，本文将就各类根管封闭剂对粪肠球菌抗菌作用的研究进展作一综述，这将具备重要的临床指导意义。

1 氧化锌丁香油类/氧化锌丁香油+碘仿类根管封闭剂

1931年，Rickert和 Dixon首次将氧化锌丁香油类根管封闭剂应用在牙髓治疗中[14]。随后，Grossman又对其进行性能改进，并提出理想根管封闭剂应该具有的十项特性：可以被轻松地输送入根管内；有很好的封闭侧支根管和根尖孔的功能；输送至根管后不会发生收缩；性能不受环境湿度的影响；有抑菌功能或者至少不会促进细菌的生长；有阻射性；不会对牙体组织染色；不会激惹根尖周组织；无菌的或者在输送至根管前很容易被灭菌；能随时轻易地从根管内取出[15]。

目前，临床常用氧化锌丁香油类根管封闭剂主要包括Endomethasone(Septodont, Saint-Maur des Fosse’s，法国)、Grossman’s(NIOM laboratory，Haslum, 挪威)、Tubli-Seal EWT(Sybron Endo Corporation, Orange，美国)、Tubli-Seal(Kerr，Romulus，MI，美国)和Tg-Sealer(Technical and General Ltd.，英国)等。研究报道，氧化锌丁香油类根管封闭剂和环氧胺树脂类根管封闭剂拥有相对最广的抗菌谱和最强的抗菌活性[16]。其抗菌作用主要来源于固化过程中释放的丁香酚成分[17]。Hasheminia等通过琼脂扩散法(ADT)证实，新鲜配制的Endomethasone对粪肠球菌抗菌作用比Tg-Sealer强，其抑菌环直径分别为(29.96±0.56)mm和(7.78±0.25) mm；但在直接接触法(DCT)中将两种材料混合后在37 ℃下放置7 d再与粪肠球菌接触发现，两者的抗菌能力无明显差别[18]。但Marcela等通过DCT研究证实，固化后的Endofill(Dentsply, Petrópolis, 巴西)在与粪肠球菌作用1 min和1 h时未表现出明显抗菌作用，24 h后具有较好的细菌抑制作用[19]。

此外，还有一类根管封闭剂是在氧化锌丁香酚粉中加入碘仿构成的，如Endoflas FS Sealer(Sanlor, 哥伦比亚)和MCS Canal Sealer(Lone Star Technologies, Westport, CT, 美国)。Arora等通过ADT法比较了氧化锌丁香油类根管封闭剂(Tubli-Seal EWT)、氧化锌丁香油+碘仿类根管封闭剂(Endoflas FS Sealer)与环氧胺树脂类根管封闭剂(AH Plus)对粪肠球菌的抗菌作用，发现其抑菌环直径分别为16.88 mm、23.20 mm和18.42 mm，即Endoflas FS Sealer的抗菌作用最强[20]。这是因为Endoflas FS Sealer中添加了碘仿。碘仿是一种温和的抗菌药物，当与组织液、体液内含有的有机物、细菌氧化酶接触后，它能够缓慢地分解出游离碘，被释放的游离碘可直接卤化菌体蛋白质，与蛋白质的氨基酸结合，而使菌体蛋白质和酶受到破坏，微生物因代谢功能发生障碍而死亡，呈现杀菌作用[21]。

2 树脂类根管封闭剂

虽然市场上根管封闭剂种类繁多，但是树脂类根管封闭剂因其良好的抗菌作用、封闭能力、理化性能和生物学特性而被广泛使用[22-25]。按其主要成分的不同可分为环氧树脂类封闭剂和甲基丙烯酸酯类封闭剂。这类封闭剂的抗菌作用主要来源于固化过程中释放的双酚A-二缩水甘油醚和甲醛成分[26]。常用的树脂类根管封闭剂有AH Plus(DentsplyDeTrey, Konstanz，德国)、EndoREZ(Ultradent，美国)、ThermaSeal Plus(Dentsply Tulsa Dental, Tulsa,俄克拉荷马州)等，其中AH Plus由于良好的物理化学性质、生物相容性和组织耐受性而常常被作为根管封闭剂研究的“金标准”[27-29]。Arora等[20]研究发现，新鲜配制的AH Plus在ADT实验中对粪肠球菌有较强的抗菌性，抑菌环直径约为18.42 mm。而Ruiz-Linares等[30]指出在DCT实验中AH Plus对粪肠球菌的抗菌作用随着作用时间延长而逐渐减弱。他通过比较细菌ATP含量发现当AH Plus固化24 h后，细菌含量与对照组相比减少80%左右，当固化后1周和4周发现细菌只减少23.28%和28.41%。Alsubait等[31]通过活死细菌染色法及细菌计数法研究发现AH Plus固化后1 d能够杀灭35%左右粪肠球菌，7 d和30 d时能够杀灭30%左右细菌。Seelan等[32]采用实时荧光定量聚合酶链式反应法(RT-PCR)，通过检测粪肠球菌中的特定基因对样本中的细菌进行定量分析，发现未固化的AH Plus 37 ℃下培养7 d后 DNA载量为1 968.72，而对照组为3 826.75，表明AH Plus有一定的抗菌作用。RT-PCR能够直接检测临床样本，不需要进行细菌培养，提高了细菌检测的灵敏性，具有更高的特异性和准确性，能够更加准确鉴别细菌种类[33]。

3 氢氧化钙类根管封闭剂

由于氢氧化钙具备修复牙髓的能力，Herman于1920年首次将其应用于牙髓治疗中[34]。1940年，Rhoner首次提出将氢氧化钙作为根管封闭剂用于临床的可能[35]。氢氧化钙类根管封闭剂主要通过固化过程中释放游离的羟基离子来提高周围环境的pH值继而发挥其抗菌作用[36]。在根管内，它能将pH值提高至12.5。研究报道，当pH>9时，氢氧化钙中游离的羟基离子通过氧化物破坏细菌细胞膜、降低酶活性、破坏细胞新陈代谢来杀死细菌[36]。

临床上常用的氢氧化钙类根管封闭剂主要有Apexit(Ivoclar Vivadent, Schaan，列支敦士登)、Sealapex(Kerr，Romulus，MI，美国)和CRCS(Coltene/Whaledent Inc.，美国)等。Dalmia等通过ADT实验比较新鲜配制的Sealapex、AH Plus、MTA Fillapex三种根管封闭剂对粪肠球菌抗菌作用，分别在24 h、48 h和72 h观察抑菌环直径大小，发现Sealpex抗菌性最强，且随着时间延长，抗菌作用逐渐减小[37]。Shakya等在ADT实验中发现新鲜配置的CRCS无论在24 h还是7 d对粪肠球菌均有抗菌作用；同时在DCT实验中发现新鲜制备的CRCS在接触1 h和24 h时粪肠球菌的细菌量均低于对照组[38]。Seelan等通过RT-PCR法发现AH Plus对粪肠球菌的抗菌作用最强，其次分别是TubliSeal、Fillapex、Apexit Plus，最后是RoekoSeal[32]。

现有关于氢氧化钙类根管封闭剂对粪肠球菌抗菌作用研究的结论并不一致，大多数研究认为其对粪肠球菌有一定的抗菌作用，但要比AH Plus的抗菌作用弱、其持续时间短[32,39]。这可能与粪肠球菌的耐碱机制有关，它可以通过细胞壁相关的质子泵驱动质子进入细胞，使细胞质酸化，这对生物体在高碱性环境下的生存起着重要的作用[40-41]。

4 硅酸钙类根管封闭剂

近年来，硅酸钙类根管封闭剂因其良好的生物相容性已得到广泛使用。该类根管封闭剂具备良好的细胞相容性、生物相容性、封闭性能和粘接性能，它们还具有一定的抗菌作用[27]。2009年iRoot SP(Innovative Bioceramix, Vancouver, 加拿大)作为该分类首个根管封闭剂应用于临床。目前临床常用的硅酸钙类根管封闭剂除了iRoot SP外，还有BioRoot RCS(Septodont，法国)和Endoseal(Maruchi, Wonju, 韩国)等。

iRoot SP是一种新型生物陶瓷类根管封闭剂，目前被广泛应用于根管治疗、根管穿孔的修补以及根尖屏障术等[42-44]。Zhang等认为它在新鲜及固化1 d时对粪肠球菌的抗菌作用比AH Plus更强，但在固化7 d时抗菌作用便会消失[45]。但Willershausen等的研究并未发现其对粪肠球菌的抗菌作用[46]。此外，Shin等比较了iRoot SP和EndoSeal对粪肠球菌的抗菌作用,发现二者未凝固时均具有抗菌作用，且EndoSeal的抗菌作用要比iRoot SP强，但凝固后的iRoot SP未显示出抗菌作用[47]。iRoot SP和EndoSeal均属于硅酸钙类根管封闭剂，它们主要通过Ca(OH)2对细胞膜或DNA的破坏和蛋白质变性对细菌产生杀菌作用[47]。但是EndoSeal含有比iRoot SP更多的具有抗菌作用的氧化物如Na2O、MgO、Al2O3、SO2、和Fe2O，这可能是二者抗菌作用表现不同的原因。

Alsubait等对BioRoot RCS和iRoot SP的抗菌作用做了比较，DCT、MDCT及活死细菌染色等研究均发现它们在配制后1 d和7 d时对粪肠球菌均具有较好的抗菌作用，且强于AH Plus的抗菌作用。但是，活死细菌染色研究还发现，BioRoot RCS配制后1 d时对粪肠球菌显示出较强的抗菌作用、7 d时抗菌作用明显减弱，但30 d时抗菌作用又有所增强，这可能与它在固化过程中离子释放的不同有关[31]。

5 玻璃离子类根管封闭剂

目前，玻璃离子类根管封闭剂种类较少，其中临床最常用的是Ketac-Endo(3M ESPE, St. Paul, MN,美国)。这类根管封闭剂的抗菌作用主要取决于氟离子释放。有研究通过ADT实验发现，未固化Ketac-Endo对粪肠球菌的抑菌环比氧化锌丁香油类根管封闭剂Roth’s Sealer(Roth International Ltd, 芝加哥，伊利诺斯州)的抑菌环大两倍；同时，该研究中DCT实验发现，未固化Ketac-Endo完全抑制了粪肠球菌的生长；但其固化24 h和7 d后样本对粪肠球菌生长没有抑制作用[48]。这与Cobankara等的研究结果基本相似[49]。

6 硅基类根管封闭剂

硅基类根管封闭剂是一种含有聚二甲基硅氧烷和牙胶颗粒的有机硅根管充填材料，它们的抗菌作用较弱，与氢氧化钙类根管封闭剂抗菌作用相类似[50]。目前常用硅基类根管封闭剂主要有GuttaFlow(Roeko/Colte`ne/Whaledent, Langenau, 德国)，GuttaFlow2(Coltène/Whaledent, Langenau, 德国)，GuttaFlow Bioseal(Coltène/Whaledent, Langenau, 德国)和Roeko Seal(Roeko/Colte`ne/Whaledent, Langenau,德国)。有研究证实，无论是固化还是未固化的GuttaFlow2和Roeko Seal在ADT或者DCT实验中对粪肠球菌均未显示出抗菌作用[18-19,51]。但是，Ruiz-Linares等在DCT实验中发现GuttaFlow Bioseal固化后1 d、1周和4周对粪肠球菌的抗菌作用随固化时间增加而加强，同时活死细菌计数法发现生存细菌数量减少[30]。另有研究将经粪肠球菌处理3周后的人牙本质块与新鲜配置Roeko Seal反应1周，RT-PCR实验发现细菌DNA载量为3 034.54，而对照组的DNA载量为3 826.75，表明Roeko Seal具有一定的抗菌作用[32]。

7 其 他

当前，氧化锌丁香油类根管封闭剂和环氧胺树脂类根管封闭剂拥有相对最广的杀菌谱和最强的杀菌活性。其对包括具核梭杆菌、变形链球菌和白色念珠菌在内的多种细菌都有有效的杀灭作用[52]。但是，其对粪肠球菌的杀灭作用较弱[53-55]。同时，目前大多数根管封闭剂仅具备一定的短期抗菌作用，这是因为抗菌作用主要来源于它们固化过程中释放的抗菌成分。但是，随着根管封闭剂的固化，抗菌成分的释放会越来越少，因此它们的抗菌作用会逐渐减弱甚至在数小时到数天内完全丧失[47,50-51]。

近年来，学者们进行了大量的研究与尝试，以求改善现有根管封闭剂的抗菌作用，提高其长期抗菌作用。比如将Kerr Pulp Canal Sealer EWT、AH Plus和RealSeal SE等根管封闭剂与阿莫西林、甲硝唑和多西环素等抗生素简单地进行混合后确实提高了根管封闭剂本身的抗菌作用，但是这种改善仅限于新鲜配制的根管封闭剂，而长期抗菌作用并未有所改善[56-57]。也有研究尝试将AH Plus、Apexit Plus和Canals等根管封闭剂与日扁柏素(hinokitiol)混合以提高其抗菌活性。结果证实，与根管封闭剂本身的抗菌活性相比较，混合日扁柏素的根管封闭剂的抗菌活性有所改善，但与此同时他们的细胞毒性作用也增加了[58]。此外，将阳离子纳米颗粒或者银离子与根管封闭剂进行混合或者对其进行包被，结果证实其可以得到强的短期抗菌活性[59-60]。季铵盐是一种广谱阳离子抗菌剂，对革兰阳性菌和阴性菌都有强的杀菌活性，目前普遍公认其杀菌机制为其表面阳离子集团可以与细菌表面的阴离子集团结合发生静电反应作用，破坏细菌细胞膜的完整性，从而杀灭细菌[60]。自20世纪70年代开始，季铵盐已被广泛应用于抗生素合成、环境消毒和水消毒等领域[61-62]。将季铵盐与根管封闭剂按照一定比例(5%～20%)混合，结果提示季铵盐显著增强了根管封闭剂的短期杀菌作用，但其长期杀菌作用并无显著改善[63-65]。程小刚等利用二氧化硅类生物玻璃作为基底，通过化学共价键结合的方式将丙烯酸酯季铵盐聚合物接枝到生物玻璃表面获得了一种可用于根管封闭剂合成的新材料。这种材料兼备长期、稳定和有效的杀菌作用以及良好的生物相容性，其固化后28 d样本对粪肠球菌表现出了长期、稳定和有效的杀灭作用[66]。然而，目前尚未转化成产品，其临床应用仍需等待一段时间。

此外，上述提及的封闭剂固化过程中所释放的抗菌成分还会引起不同程度的细胞或者组织毒性作用[67-68]，还有可能影响封闭剂的封闭效果[69-70]。大量文献已经证实根管封闭剂的新鲜制备样本的毒性最强[71-72]。氧化锌丁香油类根管封闭剂固化过程中释放的丁香油和氧化锌对人牙龈成纤维细胞、牙周膜干细胞和成骨细胞等多种细胞都有很大的毒性作用[73-74]。此外，它还能诱发软组织和骨组织的炎症反应[75]。环氧胺树脂类根管封闭剂固化过程中释放的少量甲醛和双酚A-二缩水甘油醚等成分有中等到重度程度体内和体外细胞毒性作用[76-77]。彭彬等[41,78]发现硅酸钙类根管封闭剂(iRoot SP)具备良好的细胞相容性和组织相容性，但另有研究证实它的杀菌作用在其固化后7 d便会消失[45]。当前根管封闭剂的杀菌作用和生物相容性往往呈现一个此消彼长的状态。

8 总结与展望

根管封闭剂在根管充填时使用，它将长期存在于根管内。因此，如果根管封闭剂具备长期稳定的抗菌作用，尤其针对粪肠球菌，那么无疑会增加根管治疗的成功率并维持其长期疗效。然而，通过以上文献综述发现，虽然现有根管封闭剂种类繁多、且均具备不同程度的抗菌作用，但其对粪肠球菌抗菌作用较弱、且持续时间短。截至目前，合成兼备长期、稳定和有效杀菌作用以及良好生物相容性的根管封闭剂仍然是一项艰巨的挑战，也是有关牙髓治疗研究今后探索的方向，这将为提高根管治疗成功率、维持根管治疗远期疗效和预防根管治疗失败提供新的思路和理论支持。