仿生生物分子材料在牙体硬组织再矿化中的应用

金启予，邓淑丽，胡济安

龋齿会导致牙体硬组织的破坏。随着对龋病研究的深入，许多学者发现龋病是一个脱矿与再矿化的过程。当牙齿表面有牙菌斑附着时，细菌代谢的产物如乳酸等会改变牙齿表面的微环境，使钙离子、磷酸盐离子浓度下降从而导致牙齿表面脱矿与再矿化的平衡被打破，龋病因此产生[1]。有学者临床研究发现抑制脱矿的再矿化治疗能够有效逆转早期龋损[2]。目前临床上常用的再矿化药物主要为氟及氟化物、不定形磷酸钙(amorphous calcium phosphate，ACP)制剂等。氟及氟化物低浓度再矿化的作用不明显，而过高浓度会对人体有害。此外，氟及氟化物对于光滑面龋的阻断治疗有显著效果,但对点隙窝沟龋作用有限，而后者是临床上最主要的龋损部位之一。ACP制剂主要通过增加牙齿表面钙离子和磷酸根离子浓度来促进再矿化，多用于牙膏中，作用缓慢且效果不明确[3]。

由于以上原因，临床常用的再矿化制剂存在不足，因此有些学者希望从仿生学的方面解决这一问题。本文主要讲述牙釉质和牙本质仿生再矿化材料在口腔临床治疗中的应用。

口腔中牙齿的仿生再矿化主要包括牙釉质的仿生再矿化和牙本质的仿生再矿化。根据以往的研究，牙釉质和牙本质的发育成熟都是由相应细胞或细胞外基质所调控[4]。研究这些因子对牙体硬组织矿化的作用并将之应用就是仿生再矿化材料应用的重点。

1 牙釉质再矿化

牙釉质主要为成釉细胞由内向外分泌形成的磷酸盐晶体组成。此外，釉质中有1%(质量分数)的有机物，主要为蛋白质和脂类。釉质蛋白在釉质晶体的成核和生长发育中起着重要作用。根据目前的非经典结晶理论，釉质晶体为有机无机基质相结合而形成[5]。成釉细胞分泌蛋白形成衔接釉牙骨质界和成釉细胞的雏晶。当雏晶生长至一定长度时成釉细胞分泌蛋白酶，减少釉质基质中的有机物，使雏晶停止伸长的同时加快矿物质沉积，使雏晶宽度、厚度变大而釉质发育成熟[6]。一般来讲这个过程为3～4年，在釉质发育成熟后其矿化一般不会产生变化。目前诱导牙釉质再矿化机制主要为用仿生材料使矿物离子聚集成核成为矿化中心——ACP[7]。主要的仿生牙釉质再矿化材料为釉原蛋白、多肽、树状聚合物、氨基酸、磷酸钙纳米粒子。

1.1 釉原蛋白

釉原蛋白是牙釉质发育过程中的主要结构蛋白，许多体外研究表明釉原蛋白在控制磷灰石的定向和伸长生长中起着关键作用[8]。釉原蛋白水溶胶能稳定Ca-P团簇并将其排列成线性链，然后该线性链会发展成类似釉质的共排列晶体。Ruan等[9]报道了一种新型的釉蛋白-壳聚糖(CS-AMEL)水凝胶仿生材料，用于人牙釉质再矿化(CS-AMEL水凝胶为：质量分数为2%的壳聚糖、2.5 mm钙和1.5 mm磷酸盐，过饱和度为8.23，含200 μg/mL全长釉原蛋白)。Ruan等[9]实验表明在CS-AMEL体系中，只有在一定条件下才能形成类珐琅质的有序磷灰石晶体，这取决于水凝胶粘度和过饱和度对磷灰石的协同作用。

1.2 多肽

众所周知天然的蛋白如釉原蛋白很难大量获取，因此有些学者转而进行含有相同功能的蛋白质类似物的制备。酪蛋白磷酸肽(CPP)是从乳汁中提取的与牙齿生物矿化有关的蛋白质类似物。它含有磷酸化丝氨酸残基团簇，并能通过形成非晶态纳米络合物稳定钙和磷酸根离子[10]。Kwak等[11]发现富含亮氨酸的釉原蛋白肽(LRAP)可以有效地指导针状羟基磷灰石(HAP)晶体在体外有序排列的形成，达到体外矿化效果。Kind等[12]设计了自组装肽(P11-4，Ace-Gln-Gln-Arg-Phe-GluTrp-Glu-Phe-Glu-Gln-Gln-NH2)，可以作为HAP成核所需的仿生支架树状聚合物促进龋病脱矿区釉质的再矿化。

1.3 树枝状聚合物

目前主要的树状聚合物为聚酰胺-胺型树枝状分子(PAMAM)，即人工蛋白。PAMAM作为脱矿牙釉质表面的有机框架，能诱导形成与天然牙釉质具有相同结构、方向和矿物质的HAP[13]。Yang等[14]发现通过在 PAMAM 上加载羧基基团(-COOH) 而形成了PAM-AM-COOH 聚合物。这种聚合物具有很强的自组装成具有纳米球、纳米链、微纤维以及最终组成宏观聚集体的层次结构的倾向。这种性质与人釉原蛋白相同并能促进牙釉质的再矿化。Chen等[15]通过电镜观察体外蚀刻釉质的表面PAMAM-COOH聚合物，发现PAMAM-COOH聚合物可作为釉质表面和矿化溶液中的有机模板，控制新生长晶体的成核位点和形态，从而形成类似人类釉质的仿生结构。

1.4 壳聚糖

壳聚糖(chitosan)为天然多糖甲壳素脱除部分乙酰基的产物。经学者研究，壳聚糖能用螯合作用稳定钙离子并与羟基磷灰石晶体表面结合，从而促进釉质表面再矿化[16]。姚静等[17]对壳聚糖进行磷酸化改性并和明胶进行交联形成复合物，复合物大分子膜接枝到牙体组织表面，在X射线衍射下观察到快速、致密的釉质再矿化。宋金花等[18]制备羧甲基壳聚糖(CMC)-溶菌酶(LYZ)凝胶并将其抹于酸蚀的牙釉质表面，在扫描电镜下见脱矿后的釉质表面有新的晶体形成。

1.5 磷酸钙纳米粒子

人体牙釉质矿化过程是一种有机基质介导的非经典结晶途径，非晶态纳米前体的稳定化是釉质仿生矿化中非常重要的一步[19]。ACP比磷酸钙的晶型更易溶解，因此在水溶液中很容易转化为HAP，从而促进牙釉质的再矿化。Ruan等[9]基于磷酸化蛋白在牙釉质生物矿化中的影响，合成了磷酸化壳聚糖和ACP的纳米复合物，以使牙釉质早期龋齿再矿化。研究结果表明，牙釉质再矿化后，牙釉质表面未形成类似牙釉质的结构，但损伤已再矿化。这些体外研究证明以ACP为基础的材料在预防和修复牙釉质早期损伤方面的潜力，然而，这些作用尚未在临床试验中得到证实。

2 牙本质再矿化

与牙釉质发育相同，根据非经典结晶理论，牙本质也是由无机矿化物和有机细胞外基质交替结合共同促进发育。其中无机矿化物主要为HAP，有机细胞外基质主要为成牙本质细胞分泌的胶原。成牙本质细胞分泌胶原中的Ⅰ型胶原分子被学者认为在牙本质形成过程中起重要作用[20]。当组装成原纤维时，三层螺旋状胶原Ⅰ单体分子堆积成原纤维，在电子显微镜下观察到矿物晶体周期性地连续穿过原纤维。其中带正电荷和负电荷的氨基酸残基为磷酸根及钙离子沉积提供良好的三维环境，为羟基磷灰石晶体成核提供表面。除胶原外，非胶原蛋白(non-collagenous proteins，NCP)也在牙本质发育过程中起引导作用[20-21]。非胶原蛋白主要为具有较强钙离子和HA晶体结合能力的一类酸性蛋白质，如小整合素结合配体N端连接糖蛋白(small integrin binding ligand N-1inked glyeoproteins，SIBLING)，其家族成员主要有牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein-1，DMP-1)、牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein，DSP)和牙本质磷蛋白(dentin phosphoprotein，DPP)[22]。非胶原蛋白有着稳定矿化前驱体、提供成核结构等作用。此外，同釉质矿化一样，牙本质矿化也与ACP浓度有关。因此，主要的牙本质仿生再矿化材料为胶原、非胶原蛋白、树状聚合物、磷酸钙纳米粒子等。

2.1 胶原

同上所述，胶原可以为磷酸根及钙离子提供三维网架及成核位面。因此，胶原作为牙本质仿生再矿化材料是实现牙本质再矿化的最直观材料。孔维婧等[23]采用腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)进行Ⅰ型胶原磷酸化，在透射电镜和扫描电镜下观察到50 mmol/L ATP预处理的Ⅰ型胶原及脱矿牙本质的矿化效果较对照组明显提升。李娜等[24]在胶原溶胶-凝胶体系中加入β-甘油磷酸钠(β-GP)、聚丙烯酸(PAA)和三聚磷酸钠(TPP)，构建了纳米羟基磷灰/胶原(n-HA/COL)复合支架材料。在扫描电镜下他们观察到胶原纤维组织，证实与矿化同步进行，认为陈化处理有利于HAP晶体的结晶。

2.2 非胶原蛋白

同上，非胶原蛋白(NCP)也拥有稳定无定形矿化前驱体、调控牙本质再矿化的作用。因此许多学者也尝试了使用NCP及其衍生物来诱导牙本质再矿化。He[25]发现DMP-1在体外加速了胶原原纤维的组装，并且还增加了重建的胶原原纤维的直径，由此认为DMP1和可能的其他非胶原蛋白在胶原原纤维上的特异性结合可能是胶原基质组织和矿化的关键步骤。另外牙本质基质中的DPP被认为有调控牙本质矿化过程的作用，可诱导羟基磷灰石晶体成核和生长[26]。Burwell等[27]用实验证实了用聚丙烯酸和聚天冬氨酸等阴离子聚合物形成的液态前驱体(polymer-induced liquid-precursor，PILP)可诱导人工牙本质龋的仿生再矿化。

2.3 树状聚合物

同牙釉质再矿化相同，PAMAM也能为牙本质矿化提供功能基团、结晶位点和矿化支架，从而诱导牙本质再矿化。谢方方等[28]用氧化钙溶液预处理对羧基改性的PAMAM，在扫描电镜观察到羧基改性的PAMAM协同氧化钙溶液预处理可促进脱矿牙本质的再矿化。Wang等[29]用PAMAM树状聚合物处理牙本质，然后使用傅里叶变换衰减全反射红外光谱法(ATR-FTIR)、X射线衍射(XRD)、场发射扫描电子显微镜(FE-SEM)等设备观察到涂覆在牙本质表面并渗透到牙本质小管中的PAMAM树状聚合物可诱导羟磷灰石形成。林轩东[30]同样用实验证实了3.5代羧基改性后的聚酰胺-胺树枝状高分子聚合物对人类脱矿牙本质仿生再矿化作用。吴柳鲜等[31]制备羧基改性的聚酰胺-胺/纳米羟基磷灰石[m(PAMAM-COOH):m(n-HAP)]的PAMAM-COOH/n-HAP复合材料，在体外观察证实了其于酸性环境下诱导脱矿牙本质再矿化的效果。

3 总 结

综上所述，来自于大自然的仿生生物分子材料能很好地应用于牙体牙髓临床所需的龋齿脱矿表面的再矿化。釉原蛋白、胶原蛋白及衍生物，PAMAM、磷酸钙纳米粒子能使牙釉质、牙本质再矿化。这些仿生材料一般通过提供三维网架、成核位点，稳定ACP使之结合沉积，增强表面与HA晶体亲和力，抑制早期自发性沉积等方式来促进再矿化。

但目前很多仿生材料的研究都是体外实验，能否真正应用于口腔中复杂的环境仍然未知。而许多仿生蛋白材料存在取材困难，实验时间过长的问题，实验生成的晶体强度性能与天然的釉质仍有一定差距。因此口腔仿生材料有良好的应用前景，但仍需更多的实验支持。