蛹虫草对小鼠细胞免疫及巨噬细胞吞噬功能影响

张伟云， 王 玉， 王旭东， 王志兵*

(1.长春工业大学 化学与生命科学学院， 吉林 长春 130012;2.吉林省中医药科学院, 吉林 长春 130021)

0 引 言

蛹虫草为子囊菌门，肉座目，麦角菌科，虫草属的模式种，又名北蛹虫草。蛹虫草分布广阔，在四川、辽宁、贵州、广东、吉林、河北、陕西、湖北、云南、广西、福建、安徽等地均有生长。蛹虫草功效同冬虫夏草的功效近似。并且药化、药理试验以及临床试验证明，蛹虫草可以作为冬虫夏草的代用品[1]。其功效成分主要包括氨基酸及蛋白质类、糖类、核苷酸类、虫草酸、生物碱类、SOD等化学物质[2]。蛹虫草具有抗菌、抗肿瘤及免疫调节等重要作用[3]。研究表明，蛹虫草对于荷瘤小鼠或荷肝癌小鼠的免疫功能有显著增强作用[4-5]。蛹虫草对免疫低下模型小鼠有增强免疫力作用[6-8],可以恢复因运动引起的T淋巴细胞免疫抑制[9]。蛹虫草对辐射小鼠的免疫损伤有保护作用[10]。综上可知，蛹虫草在免疫抑制、损伤方面的研究较多，对正常机体免疫能力的影响研究较少，本实验通过对正常小鼠迟发型变态反应(DTH)、腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验、ConA诱导的脾淋巴细胞转化试验、小鼠碳廓清试验，观察蛹虫草在细胞免疫功能和巨噬细胞吞噬功能的影响。旨在分析蛹虫草对正常机体内免疫能力的影响，并为其功能物质基础的深入研究以及医药和保健食品方面研发提供实验数据支持。

1 材料和方法

1.1 样品

蛹虫草粉，由铁岭市云欣虫草生物有限公司提供。人体每60 kg推荐剂量1.0 g。

1.2 实验动物

雄性KM小鼠，体重18～20 g，SPF级，由辽宁长生生物技术有限公司提供。动物室环境条件：温度19～23 ℃，相对湿度40%～65%。

1.3 剂量分组

按人体推荐量 5、10、20 倍的剂量设计，最终设三个剂量组，分别为83.3、166.7、333.3 mg/(kg·BW)，配制方法：称取受试物8.33、16.67、33.33 g，分别用蒸馏水定容至 2 000 mL，混匀，低温保存，蒸馏水为对照组。每天按20 mL/(kg·BW)灌胃给药。依据不同试验将小鼠分四组,每组包括对照组及供试品低、中、高剂量组。

1)实验一组：ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验；

2)实验二组：迟发型变态反应实验；

3)实验三组：淋巴器官/体重比值测定和碳廓清实验；

4)实验四组：小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验。

小鼠连续灌胃30 d，之后开展试验。

1.4 主要仪器和试剂

细胞离心管、96孔微量血凝实验板、T1000型电子天平、血细胞计数板、SG-603生物安全柜、550型酶标仪、LD5-2A离心机、HH-4数显恒温水浴锅、打孔器、二氧化碳培养箱、JJ-100电子天平、显微镜、JA2003型电子天平。

2,4二硝基氟苯DNFB、2%绵羊红细胞SRBC、小牛血清、印度墨汁、RPMI1640培养液、刀豆蛋白ConA、MTT、异丙醇、硫化钡。

1.5 实验方法[11-13]

参照《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版):

1)ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验。无菌取脾，置于盛有无菌Hank’s液平皿中，将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hank’s液洗2次，每次离心10 min(1 000 r/min)。然后将细胞悬浮于1 mL的完全培养液中，用台酚兰染色计数活细胞数，调整细胞浓度为3×106个/mL。将每一份脾细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1 mL，一孔加75 μL ConA液，另一孔作为对照，置 5%CO2，37 ℃ CO2孵箱中培养72 h。培养结束前4 h，每孔轻轻吸去上清液0.7 mL，加入0.7 mL不含小牛血清的RPMIl640培养液，同时加入MTT(5 mg/mL)50 μL/孔，继续培养4 h。培养结束后，每孔加入1 mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔作3个平行孔(100 μL/孔)，在570 nm波长采用酶标仪测定光密度值。

2)二硝基氟苯(DNFB)诱导迟发型变态反应(DTH)。小鼠腹部皮肤用硫化钡脱毛，范围约3 cm×3 cm，之后采用1%DNFB(试验前称取DNFB 50 mg，置清洁干燥带盖小瓶中，加入丙酮油溶液[丙酮∶麻油=1∶1]5 mL)50 μL均匀涂抹致敏小鼠后,第5天再用DNFB涂抹右耳两面进行攻击 ,24 h后处死动物，剪下左右耳壳，用打孔器取下直径8 mm的耳片,称重，以左右耳的重量之差来表示DTH的程度。

3)小鼠碳廓清试验。按体重从小鼠尾静脉注入稀释的印度墨汁(取印度墨水原液12 mL+生理盐水48 mL共稀释液60 mL，反复震荡混匀)，待墨汁注入，立即计时，注入墨汁后2、10 min，分别从内眦静脉丛取血20 μL，并立即将其加到2 mL 0.1% Na2CO3溶液(称取Na2CO30.2 g，加蒸馏水至200 mL。溶液分装到82支小试管中，每只2 mL)中。各吸0.1 mL于96孔酶标板中，用酶标仪在600 nm波长处测光密度值(OD)，以Na2CO3溶液作空白对照。将小鼠处死,取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，分别称重。以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力。

4)腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验。半体内法:制备20%的鸡红细胞悬液；每只鼠腹腔注射鸡红细胞悬液1 mL,间隔30 min，脱臼处死动物,将其仰位固定于鼠板上,正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2 mL，转动鼠板1 min。之后打开腹腔并吸出腹腔洗液1 mL,平均分滴于2片载玻片上,将加入腹腔液的载玻片小心放入垫有湿纱布的盒内，37 ℃温育30 min；孵育结束用生理盐水漂洗, 晾干,以1∶1的丙酮甲醇溶液固定5 min,再用4%Giemsa-磷酸缓冲液染色3 min, 蒸馏水漂洗晾干。油镜下计数100个巨噬细胞,计算吞噬率和吞噬指数。

1.6 数据处理及结果判定

通常采用方差分析进行数据处理，进行方差齐性检验，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对方差不齐或非正态数据进行变量转换，满足正态或方差齐后进行统计；若变量转换后仍未满足正态或方差齐，则采用秩和检验。

2 结 果

2.1 一般毒性观察

在30 d灌胃过程中，小鼠呼吸平稳、皮毛光滑、活动正常、口鼻处无明显可见分泌物，实验中小鼠无死亡。蛹虫草对小鼠体重无明显影响，各剂量组与对照组比较P>0.05，表明蛹虫草灌胃后小鼠发育正常，未见明显与受试物相关的毒性反应，见表1～表4。

表1 实验一组试验前后小鼠体重变化

表2 实验二组试验前后小鼠体重变化

表3 实验三组试验前后小鼠体重变化

表4 实验四组试验前后小鼠体重变化

2.2 蛹虫草对动物淋巴器官/体重比值的影响

蛹虫草对小鼠胸腺/体重比值和脾脏/体重比值无明显影响，各剂量组与对照组比较均为P>0.05。蛹虫草对动物淋巴器官/体重比值的影响见表5。

表5 蛹虫草对小鼠淋巴器官/体重比值的影响

2.3 蛹虫草脾淋巴细胞转化试验结果

蛹虫草中、高剂量组可以显著性增强ConA诱导的脾淋巴细胞增殖能力，与对照组比较P<0.05，见表6。

表6 蛹虫草对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化功能的影响

2.4 蛹虫草对小鼠迟发型变态反应的影响

蛹虫草中、高剂量组可以显著增强小鼠迟发型变态反应，与对照组比较P<0.05，见表7。

表7 蛹虫草对小鼠迟发型变态反应的影响

2.5 蛹虫草碳廓清试验结果

蛹虫草各剂量组均能显著提高小鼠碳廓清吞噬指数，与对照组比较P<0.05，见表8。

表8 蛹虫草对小鼠碳廓清功能的影响

2.6 蛹虫草腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验结果

蛹虫草中、高剂量组能显著提高巨噬细胞吞噬指数及吞噬率，与对照组比较P<0.05，见表9。

表9 蛹虫草对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

3 讨 论

冬虫夏草是名贵的传统中药，具有补肺、肾,益精填髓功效。大量研究表明,蛹虫草可以作为冬虫夏草的替代品[14]。

我们对铁岭市云欣虫草生物有限公司提供的蛹虫草进行细胞免疫功能和巨噬细胞吞噬功能方面的研究，细胞免疫是免疫系统的重要组成之一，可以通过控制自身抗体的产生，达到修复免疫损伤以及自身免疫调节的作用。从实验中可以看出,中、高剂量组能显著性增强ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖能力(P<0.05),显著性增强二硝基氟苯诱导的小鼠迟发型变态反应(P<0.05)，说明蛹虫草可以明显增强小鼠细胞免疫能力。

巨噬细胞作为参与机体非特异性免疫反应的免疫细胞，具有极强吞噬功能。不仅可以发挥免疫防御作用，也可以在免疫应答中实施免疫调节作用，因此巨噬细胞吞噬能力是机体免疫强度的重要指标。本实验在巨噬细胞吞噬功能方面选择腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验和小鼠碳廓清试验。发现蛹虫草各剂量组均能显著性增强小鼠碳廓清能力(P<0.05)；中、高剂量组可以显著性增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞功能(P<0.05)。说明蛹虫草可以显著提高小鼠巨噬细胞吞噬功能。

蛹虫草作为传统中药具有悠久的食用历史，其食用价值和药理作用受到越来越多的学者认可，其中免疫调节方面也有较多研究，但笔者发现蛹虫草的免疫研究主要集中在免疫抑制、损伤方面，对正常机体免疫能力的影响研究较少。本研究结果旨在分析蛹虫草对正常机体内免疫能力的影响,并为其功能物质基础的深入研究以及医药和保健食品方面研发提供实验数据支持。