IL21纳米微球抗原诱导小鼠巨噬细胞免疫应答效果的研究

(山东医学高等专科学校，山东 临沂 276000)

自2000年人白介素-21(Interleukin-21，IL21)被发现以来，其生物学作用越来越受重视。研究发现：IL21是生物调控网络中重要的一类细胞因子，其生物学作用非常复杂，既能够促进机体免疫应答，也可抑制机体免疫应答，同时对免疫应答也能起到调节作用；同时，IL21对T、B、NK以及单核巨噬细胞的激活和调控也可以起到关键的作用，是人体固有性免疫应答和适应性免疫应答的关键细胞因子。

壳聚糖及甲壳素在浓碱中脱去乙酰基可得到能够溶于酸性水溶液的聚氨基葡萄糖[1]，是一种天然阳离子性多糖化合物，具有安全、惰性、溶解速度快等优点，可作片剂、微丸剂、硬胶囊剂的药物包衣[2]，具有良好的生物吸收性和相容性，来源丰富、价格低、安全无毒，可以保护外源基因免遭细胞内溶酶体的破坏，有利于提高外源基因在细胞内的表达[3]。

本研究利用快速膜乳化-热固化联合的方法[4]制备IL21 DNA核酸疫苗，制备粒径均一可控的壳聚糖季铵盐凝胶微球，检测其对脂多糖诱导小鼠巨噬细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1实验材料 Balb/c小鼠(山东大学实验动物中心提供)，DMEM培养基、新生牛血清(Gibco)， 脂多糖(Sigma)，CCK-8试剂盒(南京建成生物工程研究所)，壳聚糖、羟丙基三甲基氯化铵等其他试剂均为国产分析纯。

1.2IL21微球的制备 处死小鼠，提取其淋巴细胞总RNA，逆转录得cDNA。根据IL21序列(Genebank)设计引物，引物Ⅰ(EcoR I)：5’-TAGCTCTGTCGCCTGGAGACTCAGTTCTG-3’，引物Ⅱ(XhoⅠ)： 5’-CCGGGATATCCTAGGAGAGATGCTGATG-3’。PCR反应体系为：94℃ 1 min，52℃ 1 min，72℃ 1 min，40次循环后72℃延伸10 min。扩增获得IL21基因片段，用于制备真核表达重组体pcDNA3.1(+)-IL21；利用烃丙基三甲基氯化铵对壳聚糖进行修饰，制备得到季铵化的壳聚糖；利用快速膜乳化技术与热固化法相结合，制备壳聚糖季铵盐凝胶微球。

1.3腹腔巨噬细胞培养及实验分组 先在小鼠腹腔注射5 ml1640培养液，轻揉腹部后处死小鼠，打开腹腔，抽取腹腔液，离心弃上清液，含小牛血清的1640培养液重悬后置于细胞培养箱培养4 h后，培养液充分洗涤，弃去未贴壁细胞，加入含1640培养液培养24 h。取巨噬细胞(5×104个/孔)接种于96孔板，共27孔，分3组(每组9孔)，分别加PBS磷酸盐缓冲液(空白对照组)、1μg/ml脂多糖(阳性对照组)、20μg/mlIL21微球与1μg/ml脂多糖(共同作用组)。其中上清液用于一氧化氮的测定，细胞用于活化caspase-3 检测。

1.4一氧化氮的测定 三组分别取100μl培养上清液与等体积Griess试剂混合，避光，振荡反应10 min后，酶标仪测量OD490nm，每组测3孔，计算平均数。

1.5活化 caspase-3 检测 各组提取巨噬细胞总RNA，通过逆转录获得cDNA。Caspase-3：5’-TGACCGAGGCTACATTCAGATGACACC-3’(上游)；5’-CAAGAGAGTTGGGCTGACCAGAAACAC-3’(下游)。β-actin：5’-AGTGTGACGTGGACATCCGCA-3’(上游)：5’-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3’(下游)。反应体系为94℃ 10 min，30个循环(94℃ 50 s，53℃ 45 s，72℃ 1 min)，72℃ 8 min。经1.2%琼脂糖凝胶电泳后，通过凝胶成像系统计算与β-actin光密度值相对表达量。每组测3孔，计算平均数。

1.6细胞增殖率的计算 各组细胞继续培养24 h，PBS充分洗涤后，调整至相同细胞数(1×105个细胞/ml)，三组再培养24 h后，每孔加入10μL CCK-8液，继续培养2.5 h后，用酶标仪于450 nm波长下测定吸光度A，每组取3孔平均数，计算细胞增殖率=[(A实验组-A对照组) /A对照组×100%]。

2 结果

2.1IL21微球的制备情况 制备获得pcDNA3.1(-)-IL21质粒核酸疫苗，经 EcoR I和XhoⅠ双酶切电泳鉴定。见图1。

图1 IL21微球鉴定电泳图

2.2IL21微球疫苗对增殖活性的影响 阳性对照组细胞增值率为(88.86±2.31)%，共同作用组为(49.50±6.34)%。两组比较有统计学意义(t=10.10，P<0.01)。

2.3IL21微球对一氧化氮释放的影响 Griess法检测表明，空白对照组、阳性对照组、共同作用组一氧化氮的释放量依次为(8.67±4.26)、(27.67±3.76)、(15.33±2.33)μmol/l。三组比较有统计学意义(F=22.18，P=0.002)，两两比较显示，阳性对照组高于共同作用组及空白对照组(q=6.03，9.28；P<0.05)，共同作用组与空白对照组之间无统计学意义(q=3.25，P>0.05)。

2.4IL21微球对caspase-3的影响 阳性对照组为(1.121±0.058)，共同作用组为(0.717±0.074)，两组比较有统计学意义(t=7.44，P=0.002)。

3 讨论

IL21为γ链家族细胞子成员之一，被认为是调节性细胞因子，能促进机体由非特异性免疫向特异性免疫的转变[5]。单核-巨噬细胞起源于骨髓造血干细胞，能够在机体免疫防御中发挥重要作用，具有广泛的生物学功能，能触发固有免疫应答，启动适应性免疫应答，包括嗜菌作用、促炎作用[6-7]。本研究通过PCR技术，体外扩增得到IL21，制备pcDNA3.1(-)-IL21核酸疫苗，经琼脂糖凝胶电泳得出，其目的基因片段为490 nm，与预计大小一致。利用快速膜乳化-热固化联合的方法制备IL21 DNA核酸疫苗。微球疫苗与小鼠巨噬细胞分组共同培养后，通过其对与巨噬细胞免疫效应的影响，考察微球疫苗对小鼠免疫应答的作用，研究结论：培养24 h后，与磷酸盐缓冲液空白对照组相比，脂多糖刺激阳性对照组细胞的凋亡明显增加，一氧化氮的释放和caspase-3的活化明显增强。

本课题组成功构建了壳聚糖季铵盐凝胶微球疫苗，可有效提高吞噬细胞杀伤功能，本研究的顺利开展为肿瘤疫苗的后续研究提供了思路和理论依据。