喷雾干燥法制备植物乳杆菌ZJ316细菌素

周青青 王月姣 顾 青 郦 萍

（浙江工商大学食品与生物工程学院 浙江省食品微生物技术研究重点实验室 杭州 310018）

近年来，随着广谱抗生素的过度使用引起的环境污染、抗生素耐药性增强等问题日趋严重。禁用抗生素的呼声响彻世界各地。欧盟等发达国家限制使用抗生素，并对产品中使用抗生素的检测标准逐步提高。减少抗生素的滥用，创制安全、绿色、无毒、高效的新抗菌剂迫在眉睫[1]。

细菌素（Bacteriocins）是一类由细菌核糖体合成，通过在靶细菌细胞膜上形成通道或直接抑制靶细菌细胞某些功能而高效发挥杀菌作用的抗菌肽[2-3]。与传统抗生素相比，细菌素抗菌活性强，不易产生耐药性，无毒副作用，无污染[4]。研究表明，细菌素对多种抗生素耐药性致病菌有显著抑杀效果。细菌素Lacticin3147[5]能有效抑制抗二甲氧基苄青霉素的“超级细菌”耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA，methicillin-resistant S.aureus）、抗万古霉素的粪肠球菌VRE（vancomycin-resistant Enterococcus）；羊毛硫细菌素MutacinB-Ny266能抑制MRSA、奈瑟氏球菌等多重耐药菌的生长[6]。细菌素有望成为替代抗生素的新一代绿色安全抗菌剂，近年来逐渐成为全球关注的热点。

细菌素产量低、生产成本高，是限制当前大部分细菌素开发和产业化应用的重要原因。为提高细菌素生产效率，现已出现一些工业生产的方法，如过滤法[7]、喷雾干燥法[8]、吸附法[9]等。过滤法简单、快速、成本低，得到的细菌素产品质量稳定，活性较好。喷雾干燥法制备细菌素时，通过调整辅料、进口温度等参数来提高细菌素产品的质量。利用pH吸附法可获取大量的细菌素[10-11]，此方法操作简单，产品得率较高，然而试验用的有机试剂会对环境造成污染。

本实验室研究人员从健康新生婴儿粪便中分离筛选得到的植物乳杆菌 ZJ316（Lactobacillus plantarum ZJ316）产生的细菌素具有广谱抑菌性，可抑制或杀死大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、单增李斯特氏菌和少许真菌等致病菌[12]。索成等[13]利用植物乳杆菌ZJ316发酵液代替抗生素乙酰甲喹喂养刚断奶的仔猪，使仔猪腹泻率和死亡率显著降低，日增重增加，肠道菌群的结构改变，猪肉品质改善。在前期研究基础上，利用喷雾干燥的方法建立细菌素制备体系，为高抑菌活性细菌素规模化生产打下基础，推进细菌素在食品工业中的应用。

1 材料与设备

1.1 菌种

植物乳杆菌（L.plantarum）ZJ316，本实验室从健康新生婴儿粪便中分离筛选得到，-80℃保藏。藤黄微球菌 10209（Micrococcus luteus 10209），购自中国工业微生物菌种保藏中心，-80℃保藏。

1.2 主要试剂和药品

胰蛋白胨、酵母、无水葡萄糖、磷酸氢二钾、无水乙酸钠、吐温-80、柠檬酸三铵、七水硫酸镁、牛肉浸膏、硫酸锰、氯化钠、琼脂粉、氢氧化钠、一次性使用无菌注射器、水系微孔过滤膜0.22 μm，购于永华化学科技（江苏）有限公司；麦芽糖、乳糖、D-果糖、蔗糖，购于国药集团化学试剂有限公司；Nisin（2.5%，potency：106IU/g），购于Sigma公司；脱脂奶粉、玉米淀粉、食盐，均为市售。

1.3 培养基

LB培养基、MRS培养基，按文献[14]配制。

1.4 主要仪器和设备

微型喷雾干燥仪，Buchi B-290，瑞士Buchi公司；生物膜过滤系统，赛多利斯16828，德国赛多利斯公司；生物安全柜，Thermo，USA；生化培养箱，SPX-150B-Z型，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；分光光度计pHarmaSpec UV-1700，SHIMADZU，Japan；全自动灭菌锅，Tuttnauer，USA；恒温水浴锅，DK-8D，上海精宏实验设备有限公司；pH酸度计 PB-10，Startorius；小型离心机，Thermo，USA。

2 试验方法

2.1 菌种活化

菌种活化：将-80℃保藏的菌种用划线的方法活化 （植物乳杆菌ZJ316划线于MRS固体培养基，指示菌M.luteus 10209划线于LB固体培养基），30℃过夜培养。挑取单菌落于相应液体培养基，30℃培养过夜。

2.2 植物乳杆菌ZJ316发酵上清液制备

已活化的植物乳杆菌ZJ316按照3%的接种量接种于6 L MRS液体培养基，30℃静置培养24 h。发酵液离心（4℃，8 000 r/min，20 min）得到上清，并用膜分离系统过滤（0.22 μm 膜），4℃储藏待用。

2.3 蛋白质浓度的测定

样品称重，溶于300 mL超纯水，利用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定样品蛋白质浓度。配制梯度浓度的牛血清蛋白 （BSA）标准溶液：0，25，125，250，500，750，1 000，1 500，2 000 μg/mL，测定标准溶液OD562值。以标准溶液蛋白浓度为横坐标，对应的OD562值为纵坐标制作标准曲线，得到线性标准方程，根据此方程计算样品溶液的蛋白质浓度。

2#危岩体(W2)分布于1#危岩体上部，危岩体高10～12 m，宽60.0～75.5 m，厚4～6 m，体积约6 435.0 m3，危岩体前缘陡直临空，局部呈凹腔状，主要受两组裂隙和层面切割。切割成的单体危岩呈块体状，其南侧为垂直临空面，岩体表面横竖向构造节理裂隙发育，主要受三组裂隙和层面切割，节理密度为6～10条/10米，节理切割深度2.0～3.5 m。切割成的单体危岩呈块体状，其东、西、南三侧为垂直临空面，上部为风化碎块石，下部为片麻岩；节理裂隙多松弛张开、外倾，局部已贯通。危岩体顶部堆积有风化碎块石。

2.4 样品效价与比活力的测定

在一定浓度范围内，效价的对数值与牛津杯法的抑菌圈直径成直线函数关系[15-17]。以不同浓度（1 000，800，600，500，400，200，100和 50 IU/mL）Nisin标准样品所形成的抑菌圈直径为纵坐标，对应效价值的对数值lg（IU）对横坐标，绘制标准曲线。效价值除以蛋白质浓度等于产品比活力（IU/mg），可衡量样品中有效成分（细菌素）的抑菌活性。

2.5 喷雾干燥辅料的选择

将玉米淀粉、蔗糖、食盐、脱脂奶粉4种辅料以15%的体积比加入超纯水中，进行喷雾干燥。干燥条件：进风温度135℃、风机工作效率95%、蠕动泵工作效率20%、每分钟通针5次，收集样品做抑菌试验。

2.6 喷雾干燥制备细菌素的条件优化

在辅料确定的前提下，对喷雾干燥的影响因素（食盐添加比例、进口温度、风机工作效率、蠕动泵工作效率）分别进行单因素优化，选取显著因素进行正交试验优化。喷雾干燥后，均收集样品并及时称重，做抑菌试验和测蛋白质含量。优化试验过程中，喷雾干燥样品需完全混合均匀，每分钟通针5次，每个试验重复3次。

2.6.1 食盐添加比例的影响 将不同体积比（5%，10%，15%，20%，25%） 的食盐加入发酵上清液中，完全溶解后进行喷雾干燥，干燥条件：进风温度135℃、风机工作效率95%、蠕动泵工作效率20%。

2.6.2 进口温度的影响 将20%体积比的食盐加入到发酵上清液，完全溶解后进行喷雾干燥，进口温度分别设定为 125，135，145，155，165℃。喷雾干燥机其它工作参数：风机工作效率95%、蠕动泵工作效率20%。

2.6.3 风机工作效率的影响 将20%体积比的食盐加入到发酵上清液，完全溶解后进行喷雾干燥，风机的工作效率分别设定：80%，85%，90%，95%和100%。喷雾干燥机其它工作参数：进口温度155℃、蠕动泵工作效率20%。

2.6.5 正交试验 以食盐添加的体积比、进口温度、风机工作效率、蠕动泵工作效率作为影响因子，进行四因素三水平的L9（34）正交试验。正交试验水平因素设计见表1。

表1 正交试验因素水平表Table1 Factors and levels of orthogonal test

3 结果与讨论

3.1 蛋白质浓度标准曲线

用BCA法确定蛋白浓度测定标准曲线，获得的线性方程式为y=0.0013x+0.0613（R2=0.9975），如图1。该标准曲线线性较好，可用于测定样品蛋白浓度。

图1 蛋白质量浓度测定标准曲线Fig.1 Standard curve for quantitative analysis of protein

3.2 蛋白质效价标准曲线

以Nisin为标准品制作标准曲线来衡量样品的抑菌效果。如图2所示，标准曲线方程式为y=4.4255x+12.7836，线性程度较好（R2=0.9970），可用来衡量发酵上清液的抑菌效果。

图2 Nisin效价的标准曲线Fig.2 Standard curve of activity assay

3.3 辅料的比较和选择

经验证，食盐等4种辅料均无抑菌效果，但对样品的得率与品质都有很大影响。食盐为辅料时，样品得率最高为80.46%，抑菌效果最好。奶粉为辅料时，样品的得率与抑菌活性没有以食盐为辅料时高。以蔗糖为辅料时，喷雾干燥后的样品都粘附在收集器皿侧壁上，无法取样。从制备样品的外观看，以食盐为辅料的样品品质最好，蓬松且不易吸潮，奶粉次之，淀粉最不理想。而且以食盐为辅料的样品水溶性最好，奶粉次之，以淀粉为辅料的样品不溶于水。综合考虑，选择食盐为辅料进行下面的优化试验。

图3 辅料对细菌素样品品质的影响Fig.3 Effect of different excipients on quality of the bacteriocin samples

3.4 食盐添加量对喷雾干燥制备细菌素的影响

发酵上清液按不同体积比加入食盐后，所得样品比活力随着食盐浓度的增加而下降。如图4所示，当食盐添加量为5%时，产品得率较低，抑菌活性较差。随着食盐浓度增加，得率呈先降低后增加的趋势。当食盐添加量为20%时，样品溶液的抑菌活性最好，效价为 2 337.801 IU/mL（P＜0.05）。当食盐添加量高于20%时，抑菌活性明显下降。因此，选取20%的食盐浓度为最佳辅料比。

3.5 进口温度的优化

由图5可知，随进口温度升高，得率不断增加。当温度为165℃时，样品得率最高为86.713%。155℃时，样品比活力与抑菌活性达到最高，分别为94.137，2 739.479 IU/mL（效价有显著性增加P＜0.05）。在测定过程中发现当进口温度为165℃时，样品的得率较高为86.713%，但效价值降到2 312.625IU/mL，在此温度下细菌素活性受到影响。综合考虑，选择155℃为最佳进口温度。

图4 食盐添加量对细菌素样品品质的影响Fig.4 Effect of different salt content on quality of the bacteriocin samples

图5 进口温度对细菌素样品品质的影响Fig.5 Effect of different inlet air temperature on quality of the bacteriocin samples

3.6 风机工作效率的参数确定

风机功率低时，风速小，产品不易干燥，水分蒸发不彻底，导致成型困难，得率低；风机功率高时，风速大，水分蒸发快，成型迅速，损失小，得率高。不考虑发酵液质量的情况下，随风机工作效率提高，样品的得率与抑菌活性（P＜0.05）也呈现增长趋势。当工作效率为100%时，其得率与效价值达到最高值分别为87.132%、2 788.243 IU/mL，在此条件下单位样品的活力为2.400×104IU/g。风机工作效率对样品的得率、蛋白含量、比活力、抑菌活性均有影响。风机的工作效率为100%为最佳条件。

3.7 蠕动泵工作效率的参数确定

蠕动泵对样品的得率与抑菌活性有明显的影响，对比活力影响不大。当工作效率大于20%，随泵速的提高，样品得率与抑菌活性不断降低。在蠕动泵工作效率为35%时，样品的得率仅为49.582%，效价值为1 306.413 IU/mL，单位样品的活力为7 904.560 IU/g。随着泵的工作效率的增加，进料速度加快，样品没有完全干燥。综合考虑。因此选取20%为蠕动泵的工作效率。

图6 风机工作效率对细菌素样品品质的影响Fig.6 Effect of different air-blower on quality of the bacteriocin samples

图7 蠕动泵工作效率对细菌素样品品质的影响Fig.7 Effect of different feed flow rate on quality of the bacteriocin samples

3.8 正交试验结果

选取食盐添加量、进口温度、风机工作效率、蠕动泵工作效率4个影响因子，每个因子取3个水平，进行四因素三水平的L9（34）正交试验。结果见表2。

表2 四因素三水平正交试验方案与结果Table2 Result of orthogonal experiment

由表3正交试验结果可知，样品抑菌活性最高的试验条件为食盐添加量20%、进口温度155℃、风机工作效率100%、蠕动泵工作效率10%，此时单位样品的活力是2.476×104IU/g。根据对三水平的极差分析，4种因素对产品抑菌活性影响力的大小依次是蠕动泵工作效率＞风机工作效率＞食盐添加量＞进口温度，最佳组合为A2B2C3D2。

4 结论与讨论

我国是一个乳酸菌资源丰富的国家，很多乳酸菌来源于食品、人畜肠道及少数临床样本，随着对乳酸菌及其细菌素研究的不断深入，乳酸菌细菌素在抑菌性、安全性及其它活性研究方面逐渐被认识。乳酸菌细菌素作为一种最具发展前途的天然防腐剂，可降低食品灭菌温度，提高食品品质，缩短食品灭菌时间，减少食品营养破坏，延长食品保质期。目前，全世界已有60多个国家和地区将乳酸链球菌素作为食品防腐剂添加到肉类、罐头、乳制品、蔬菜和啤酒等食品中。但只有Nisin一种细菌素被商业化，由于其抑菌谱窄，只能抑制部分革兰氏阳性菌，使应用受到了极大的限制[18]。

本研究利用从健康新生婴儿粪便中分离筛选得到产细菌素的L.plantarum ZJ316为试验菌株，利用喷雾干燥技术将其发酵上清液制备得到细菌素产品，优化了喷雾干燥试验条件（食盐添加量、进口温度、风机工作效率、蠕动泵工作效率），利用食盐作为辅料时，可使产品质地蓬松，水溶性好，不易吸潮，这些特点类似于商品化的Nisin。该研究建立细菌素高效制备体系，有望实现细菌素制品在食品工业、医药制品、畜牧产品中的应用。