细胞悬液“十”字轨迹运动促进细胞均匀分布的研究

唐月连，陈 权，李晓毅，王 颖，陈鸿鹏，刘肖雨1,，赵 威，刘玉婷，陈艺琳1,，刘新光，孙雪荣（广东医科大学 1. 东莞科研中心衰老研究所，2. 医学检验学院，3. 信息工程学院，. 第二临床医学院，5. 药学院，6. 基础医学院，7. 广东省医学分子诊断重点实验室，广东东莞523808；8. 生物化学与分子生物学研究所，广东湛江 52023）

在贴壁细胞体外培养的过程中，经常需要进行传代[1-2]。在传代过程中，细胞悬液种板后，细胞贴壁和分布是否均匀，是影响细胞功能及后续实验的重要因素[3-5]，如何使细胞分布均匀是至关重要的问题。由于目前缺乏统一且标准化的细胞均匀分布的方法或仪器，科研人员大多通过手工或生物摇床对培养板等进行摇动，以达到细胞均匀分布，但是每个人的操作手法不一样，摇床的参数也各不相同，效果也参差不齐。哪种摇动方式更容易使细胞均匀分布？目前尚未见研究报道。我们在实验中发现，使液体在垂直方向做相对运动，即“十”字轨迹运动，能使细胞分布较好。因此，为了比较不同摇动方式对细胞分布的影响，本文通过手工或摇床对种板后的细胞悬液进行摇动，比较并筛选出能使细胞均匀分布的摇动方式，为科研工作者做细胞传代提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料和仪器

胎牛血清；DMEM生长液；黑色素瘤A375细胞购自中国科学院上海细胞库；胰酶；12孔板；100 mm培养皿；普通生物摇床(WD-9405D)购自北京六一生物科技有限公司；倒置相差显微镜(TS100,Nikon)。

1.2 方法

1.2.1 细胞传代和种板 用含10%胎牛血清的DMEM生长液培养黑色素瘤A375细胞(中国科学院上海细胞库)，待细胞生长至约80%融合后，经胰酶消化和生长液中和后，离心去上清，再用生长液重悬。分别取含5×104和5×105细胞重悬液，种板于12孔板或100 mm培养皿中，用不同的摇动方式混匀细胞后，置于37 ℃，饱和湿度的培养箱中进行培养，24 h后在倒置相差显微镜(TS100，Nikon)下观察和拍照。

1.2.2 细胞悬液的摇动方式 细胞悬液种板后，采用不同的摇动方式混匀细胞，然后置于培养箱中培养，每个实验至少重复3次。本研究采用了3种不同的摇动方式：(1)不规则摇动，细胞种板后，不做特殊处理，简单摇晃后置入培养箱中；(2)生物摇床摇动，将培养板置于普通生物摇床上(WD-9405D，北京六一生物科技有限公司)，在水平面做椭圆形运动，30～40 r/min，摇动约1 min后，置于培养箱中培养；(3)“十”字交叉摇动方式，根据培养板或培养皿大小不同，采用两种不同的摇动手法，使细胞悬液呈“十”字轨迹运动。针对面积小的12孔板，在水平面做前后、左右方向“十”字运动，先左右运动10个来回，再在垂直方向10个来回，依此交替，时间约1 min，针对面积较大的100 mm培养板，分别以水平面X轴和Y轴为枢纽，进行前后、左右的“跷跷板”式摇动，使液体呈垂直交叉运动，每个方向来回摇动10次左右，并交替进行，时间约1 min。

2 结果

不规则、椭圆形及“十”字轨迹摇动方式对细胞分布的影响如下：

(1)不规则摇动：研究发现，将A375细胞悬液种于12孔板后，进行简单的不规则摇动，然后置于培养箱中，可见细胞分布明显不均匀，中间区域细胞密集，甚至重叠，出现细胞因营养不足脱落死亡；而周边区域细胞分布较稀疏，虽营养充足但细胞相互交联少出现轮廓不清，生长速度缓慢等不良状态(图1A～1C)。

(2)椭圆形摇动：将含细胞悬液的12孔板用生物摇床在水平面上进行椭圆形摇动后，再进行培养，结果发现，其细胞分布相对于不规则摇动更加均匀，但培养孔中央区域仍有一定的细胞聚集区，亦使集聚区细胞脱落死亡(图1D～1F)。

(3)“十”字轨迹摇动：根据培养板、皿的大小不同，我们采用了不同的摇动方式，使培养悬液呈“十”字交叉运动。对于直径小于或等于60 mm的培养皿，或普通细胞培养板(6孔板、12孔板)等，可采用水平面的“十”字轨迹运动方式，即细胞种板后，用手工操作对培养皿/板进行水平面的“十”字轨迹运动，交替在前后和左右方向进行来回运动(图1G，H)，然后放入培养箱培养。本研究以12孔板为例进行测试，结果发现，与不规则摇动和椭圆形摇动方式相比，“十”字轨迹运动可使细胞分布更加均匀(见图I)。而对于直径大于100 mm的培养皿，水平面的“十”字轨迹运动容易使液体溢出，为此，我们用了“跷跷板”式的“十”字摇动方式，即以手工方式将培养皿分别以X轴和Y轴为支点，进行前后、左右摇动(图J，K)，这种运动方式相对温和，液体不容易溢出。我们用100 mm培养皿进行了测试，发现种板后细胞分布均匀，细胞轮廓清晰，效果与水平面的“十”字轨迹运动类似(图L)。

3 讨论

在贴壁细胞传代培养过程中，不仅需要将细胞重悬并转移至新的培养板、皿或瓶中(简称为种板)，还需摇动生长液使细胞均匀分布。细胞贴壁后如分布不均匀，会对后续实验造成困扰。如果细胞分布不均匀，会造成细胞在培养基中获得营养成分多寡不同，且繁殖速度也不一样。种板太密的地方，细胞获取营养成分困难，并出现接触抑制，从而限制了生长；细胞太稀的地方，因细胞之间“交流”减少，生长速度也可能减慢；而密度适中的地方，细胞状态和生长速度均较佳，且均一性好。参差不齐的细胞密度和生长方式，对后续实验影响较大，因此，如何使细胞分布均匀，是不少实验工作者经常遇到的难题。

图1 不同摇动方式对细胞分布的影响细胞分布的影响

为了使细胞均匀分布，许多科研工作者用手工摇动的方式混匀细胞悬液，但操作方式因人而异，效果良莠不齐，究竟哪种摇动方式比较好，尚未见报道。有些实验室则使用生物摇床对种板的细胞进行混匀，摇床的运动方式大多为水平椭圆形、圆周式摇动、左右摆动或不规则震动等，形状大小功率等参数各不相同，某些摇床虽然可用于混匀细胞悬液，但参数不容易掌握，且效果不大稳定。目前专业用于细胞种板的摇床很少见，更多的摇床是用于悬浮细胞的培养和震荡[6]。

本实验表明，不规则摇动容易使细胞出现分布不均，密集区域细胞因营养不足，生长空间受限，出现细胞死亡脱落，而稀疏区域细胞虽营养空间充足，但因缺乏细胞间相互作用而出现生长缓慢等表现；而椭圆形摇动种板细胞生长情况较不摇动方式好，其产生的分布密度差异相对较小，但仍有部分细胞分布不均匀。相较于前面两种方式，“十”字轨迹运动可发挥有效混匀细胞的作用，培养后细胞分布均匀，形态轮廓清晰，生长状态良好。

针对不同大小的培养皿/板，采用了不同的“十”字摇动方式。其中水平面“十”字轨迹摇动方式使用较多，这种运动方式的作用力较大，液体移动速度也较快，适合于直径较小的培养板/皿，如6孔板、12孔板及35 mm、60 mm培养皿等，因这些规格的培养板/皿，培养面积小，液体移动距离短，故需要较大的摇动力度。但对于直径较大的培养皿，如100 mm及以上培养皿，其液体可运动的距离远，作用力也相对增大，此时再用水平面“十”字运动方式可造成液体飞溅逸出。因此，选用了较温和的“跷跷板”式“十”字运动，这种方式是以X轴和Y轴为支点，前后、左右交替摇动培养皿，其混匀效果好，同时又不至使液体溅出。

生物摇床经常用于混匀溶液或细胞等，摇床的机械运动可通过横纵向摇杆、悬臂、万向定位滑轮和电生磁场发生振荡等多种方式实现各种运动，但目前市面鲜见专用于细胞培养，使生长液呈“十”字轨迹运动的摇床。本文为进一步开发相关的细胞培养专用摇床提供了依据。当然，要让“十”字轨迹运动摇床适用不同的培养皿、板或瓶，还需要进行大量的实验研究，才能得出频率、振幅和时间等科学有效的数字化参数。