Tribble同源蛋白3表达对胃癌细胞增殖的影响

黄维甄，李 俊，董少婷，谢 丹 （广东省惠州市中心人民医院肿瘤内科，广东惠州 516000）

胃癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，严重危害人类健康[1]。手术是目前根治胃癌的主要方法。然而，胃癌术后复发和转移的概率仍然很高，中位生存期仅有7.5～12个月[2]。因此，寻找胃癌中的关键调控基因及探究其作用机制，有望为胃癌的防治提供新思路和新靶点。Tribble同源蛋白3(TRIB3)是一种重要的应激相关蛋白[3]，在细胞凋亡、脂肪细胞分化、细胞应激等过程中发挥着重要作用[4]。研究表明，TRIB3在乳腺癌[5]、结直肠癌[6]、肺癌及肝癌[7]等肿瘤组织中高表达，并与患者的不良预后密切相关，提示TRIB3可能是肿瘤发生、发展的重要调控基因。本文就TRIB3是否参与胃癌进展及其具体作用机制作一研究。

1 资料和方法

1.1 收集资料

利用Cbioportal在线软件(https://www.cbioportal.org/)分析TRIB3基因在不同肿瘤中的突变情况，选择TCGA Pan Cancer Altlas Studies数据集进行TRIB3基因突变情况分析。

1.2 分析胃癌中TRIB3的表达

分别从The Cancer Genome Atlas Program(TCGA，https://www.cancer.gov/)和 Gene Expression Omnibus(GEO，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站下载含胃癌mRNA表达的数据集(GSE79973)，以分析TRIB3在胃癌及癌旁组织中的表达情况。

1.3 分析TRIB3表达与胃癌患者预后的关系

利用Kaplan-Meier Plotter在线软件(http://kmplot.com/analysis/)分析TRIB3表达与胃癌患者预后的关系，TRIB3高低表达的截取值为系统自动选择最佳截取值。

1.4 主要试剂和材料

胃癌细胞株BGC823和MKN45由本实验室提供；DMEM培养基、胎牛血清(FBS)购自GIBCO公司；CCK-8试剂由日本同仁公司生产；RIPA裂解液、蛋白酶体抑制剂、磷酸酶抑制剂、BCA试剂盒等购自碧云天公司；siRNA由广州锐博公司设计并合成；TRIB3过表达慢病毒购自上海吉凯公司；Lipofectamine RNAiMAX购自英潍捷基；抗体购自Abcam；ChIP试剂盒购自赛默飞公司；western blot发光系统购自Bio-Rad公司。

1.5 细胞培养

胃癌细胞株BGC823、MKN45培养于含10%FBS的DMEM培养液中；细胞均在37 ℃、5% CO2恒温细胞培养箱中培养，每隔2～3 d换液、传代。

1.6 CCK-8法检测细胞增殖

取对数生长期的BGC823和MKN45细胞，以1 000 个/孔接种于96孔板中，每孔设3个复孔，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。收集相应时间点细胞，弃旧培养基，每孔加入含有10% CCK-8的新鲜培养基，37 ℃、5% CO2培养箱中孵育2 h，450 nm吸光值，绘制生长曲线。

1.7 western blot检测蛋白表达

细胞相应处理后，用PBS清洗2次后，收集细胞，6孔板每孔加入100 μL RIPA裂解液抽提细胞总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度；5×上样缓冲液与总蛋白以5:1混合后，95～100 ℃加热5～10 min。取出20 μg蛋白质行SDS-PAGE凝胶电泳分离，恒压100 V将蛋白转移至PVDF膜。5%BSA封闭1 h后，相应一抗孵育蛋白，4 ℃摇床孵育过夜。次日用TBST洗膜3次，每次5 min，对应二抗孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min。用Bio-Rad化学发光系统显色成像。

1.8 蛋白质免疫共沉淀

细胞相应处理后，取1×107个细胞，用1 mL含适量蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂的western和IP裂解液裂解细胞，静置30 min后15 000 g ×15 min离心取上清，加入相应一抗，4 ℃摇床孵育过夜，加入20 μL Protein A/G琼脂糖珠子孵育30 min，用western和IP 裂解液裂解洗珠子5次，2×上样缓冲液洗脱蛋白质结合复合物，95 ℃加热10 min变性，继续后续western blot实验。

1.9 免疫荧光

细胞爬片作相应处理后，PBS洗细胞爬片2遍，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗细胞爬片2遍，0.25% 曲拉通打孔5 min，PBS洗细胞爬片2遍，山羊血清封闭1 h，相应一抗4 ℃ 孵育过夜，PBS洗细胞爬片2遍，室温孵育二抗1 h，PBS洗细胞爬片2遍，DAPI三合一封片剂封片，荧光显微镜拍照。

1.10 染色质免疫共沉淀(ChIP)

将胃癌细胞接种于10 cm大皿中，加入37%甲醛使甲醛终浓度达1%，室温孵育10 min，加入2.5 mol/L甘氨酸室温孵育5 min终止交联。用含蛋白酶抑制剂的PBS洗细胞2次，收集细胞，加入含蛋白酶抑制剂的SDS Lysis buffer裂解细胞，超声破碎(VCX750，25%功率，冲击4～5 s，间隙9 s，共14次)。14 000 g离心10 min，取上清，留取部分细胞裂解液，剩余部分上清加入5 μg相应抗体，4 ℃摇床孵育过夜，加入20 μL Protein A/G琼脂糖珠子孵育30 min，清洗磁珠5次，解交联，回收DNA片段，PCR检测。ChIP PCR引物见表1。

表1 引物序列及产物大小

1.11 siRNA转染

由广州锐博公司设计并合成特异性敲除TRIB3、β-catenin的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)。利用Lipofectamine RNAiMAX转染试剂将相应的siRNA转染入胃癌细胞中。

1.12 构建TRIB3稳定过表达细胞株

由上海吉凯公司设计并合成TRIB3过表达慢病毒，慢病毒感染按吉凯公司慢病毒转染说明书操作。待感染TRIB3过表达慢病毒后，利用嘌呤霉素筛选TRIB3阳性克隆，2周后收集细胞，提取细胞总蛋白检测TRIB3表达情况。

1.13 统计学处理

采用SPSS22.0软件进行统计学处理，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TRIB3在胃癌中的表达情况及其与预后的关系

TRIB3在多种肿瘤中均出现不同程度的扩增或者突变(图1A)。与癌旁组织相比，TRIB3在胃癌组织中显著高表达(图1B)，差异有统计学意义(TCGA：P<0.01，GSE79973：P<0.05)。TRIB3高表达的患者其总生存及无进展生存时间明显较TRIB3低表达患者的总生存及无进展生存时间短(图1C，P<0.01)。

2.2 TRIB3对胃癌细胞增殖的影响

过表达TRIB3能明显促进胃癌细胞的增殖(图2A)，而干扰TRIB3能明显抑制胃癌细胞的增殖(图2B)，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.3 TRIB3与β-catenin对c-Myc、CyclinD1的影响

过表达TRIB3能上调β-catenin及其下游靶基因c-Myc、CyclinD1的表达(图3A)。免疫共沉淀显示TRIB3能 与 β-catenin结合 (图3B)。 免疫荧光显示TRIB3与β-catenin存在明显的共定位(图3C)。过表达TRIB3能够促进β-catenin与c-Myc、CyclinD1启动子区结合(图3D，P<0.01)。

2.4 TRIB3通过β-catenin促进胃癌细胞的增殖

过表达TRIB3能明显促进胃癌细胞的增殖(P<0.01)，敲除β-catenin能抑制胃癌细胞的增值(P<0.01)，且沉默β-catenin能消除过表达TRIB3对胃癌细胞增殖的促进作用(P<0.01)，见图4。

图1 TRIB3在胃癌中的表达情况及其与预后的关系

图2 TRIB3对胃癌增殖的影响

图3 TRIB3与β-catenin结合促进c-Myc、CyclinD1的表达

3 讨论

TRIB3是一种没有激酶活性的假激酶蛋白，其在肿瘤表达及进展中的作用存在争议[8]。有研究表明TRIB3作为NF-kB的负性调控因子能够抑制肿瘤进展[9]，而Hua等[10]发现TRIB3能够通过与SMAD3结合促进TGF-β诱导的肿瘤细胞侵袭及转移。那么TRIB3在肿瘤中的表达情况究竟如何呢？我们利用Cbioportal在线软件分析TRIB3基因在不同肿瘤中的突变情况，结果显示TRIB3在多种肿瘤中均出现不同程度的扩增或者突变，尤其在卵巢癌、子宫癌及肺鳞癌中突变率最高，提示TRIB3在多种肿瘤中均可能存在异常表达。

TRIB3在胃癌中的表达及功能研究报道较少，那么TRIB3在胃癌中表达如何，其与胃癌进展之间是否存在关联？本研究通过分析TCGA、GSE79973数据集中TRIB3在胃癌及癌旁组织中的表达情况，明确TRIB3在胃癌中显著高表达，且其高表达与胃癌患者不良预后有关。功能分析发现TRIB3能够促进胃癌细胞的增殖。这些实验结果提示TRIB3可能作为癌基因促进胃癌细胞的增殖，且TRIB3可能作为胃癌患者不良预后的分子指标。由于本实验部分结果是基于公共数据分析所得，未来仍需要结合临床实验进一步验证TRIB3是否可以作为胃癌患者不良预后的分子标记物。

图4 TRIB3通过β-catenin促进胃癌细胞的增殖

Wnt/β-catenin信号通路在正常细胞的增殖、分化、发育和维持中起关键作用，且在胃癌的增殖、侵袭及转移中发挥重要的生物学作用[11-12]。Wnt/βcatenin信号通路可启动下游靶基因(如c-Myc、CyclinD1、COX-2等)的转录，促进肿瘤细胞增殖。研究表明结直肠癌中的TRIB3通过与β-catenin结合维持结直肠癌肿瘤干细胞的特性。而TRIB3是否通过调控Wnt/β-catenin信号通路促进胃癌的进展目前仍不清楚。本研究发现TRIB3能够上调Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因Myc和CyclinD1 的表达，而Myc和CyclinD1与胃癌细胞的增殖密切相关，且TRIB3可以与β-catenin结合，进一步促进β-catenin与下游靶基因c-Myc、CyclinD1的启动子区结合，并促进二者转录激活，进而促进胃癌细胞的增殖。这一发现为进一步理解胃癌的发展机制提供了新的理论依据，有望为胃癌的防治提供新思路和新靶点。