人p54nrb基因真核表达载体的构建及其在HepG2细胞内的表达

陈春玲，闫吕彬，牛 伢，吴嫦丽，张秀娟*（广东医科大学 . 生理学教研室；. 图书馆，广东湛江 5403）

54 kDa核DNA、RNA结合蛋白(54kDa nuclear RNA-and DNA-binding protein，p54nrb)也称Non-POU domain containing octamer-binding protein(NONO)，是一种主要分布于细胞核，且能与DNA、RNA结合的多功能核蛋白[1]。在细胞核内，p54nrb参与多种核内生物学过程，如初级mRNA的剪接[2]、DNA的损伤修复[3]、DNA解螺旋[4]、基因的转录调控[5]、缺陷RNA核滞留等[6]，p54nrb基因突变或异常可引起广泛的基因mRNA谱表达异常。p54nrb是核蛋白体结构paraspeckle的核心组成蛋白[8-9]，paraspeckle的功能是参与A-I超编辑RNA的核滞留过程。p54nrb核内功能的多样性决定了其生物功能的多样性，可参与生物节律的调节[10]，并与神经系统发育[11]及肿瘤的发生、转移等密切相关[12-14]。为了进一步研究p54nrb基因的功能，我们构建了p54nrb基因真核表达载体，并观察了其在人肝癌细胞HepG2内表达，为后续研究p54nrb基因的生物功能提供载体。

1 材料和方法

1.1 材料

pcDNA3-HA及pcDNA3质粒、HepG2 细胞由广东医科大学生理学教研室保存。鼠抗HA单克隆抗体购自sigma公司；Alexa-Flour 488 标记的羊抗鼠IgG抗体购自中杉金桥。ReverTra Ace-α-™ kit、XhoI和KpnⅠ限制性核酸内切酶、Ligation High DNA连接酶、KOD-Plus-Neo酶购于TOYOBO公司；Lipofectamine 2000脂质体转染试剂购于Invitrogen公司；质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒购于Aidlab 公司；总RNA提取试剂盒购于Axygen公司；胎牛血清及培养基购于Hyclone公司。

1.2 方法

1.2.1 HepG2细胞总RNA的提取 将对数生长期的HepG2细胞接种于细胞培养皿中，在细胞生长至80%～90%融合时，收取细胞，按Axygen总RNA制备试剂盒使用说明书提取总RNA。

1.2.2 RT-PCR扩增人p54nrb基因的蛋白编码序列提取总RNA，并以总RNA为模板反转录合成cDNA。取反转录生成的cDNA 2 μL，PCR扩增人p54nrb基因的蛋白编码序列，PCR反应的上游引物为：5'- CGG GGTACCATGCAGAGTAATAAAACTT TTAACTTG G-3'；下游引物：5'- CCGCTCGAGGTATCG G CGA CGTTTGTTTGG -3'；其中GGTACC为KpnI 酶切位点，CTCGAG为XhoI 酶切位点。PCR 反应条件设定为94 ℃、30 s，56 ℃、30 s，68 ℃、2 min，40个循环。用1%琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行电泳，使用天能凝胶图像分析系统对凝胶进行照相。使用Axygen DNA凝胶回收试剂盒切胶回收p54nrb PCR产物。

1.2.3 pcDNA3-p54nrb-HA载体的构建及鉴定 使用XhoI和KpnI限制性内切酶对p54nrb RT-PCR扩增产物及pcDNA3-HA质粒分别进行双酶切，并将酶切产物切胶回收，用DNA连接酶将酶切产物在16 ℃下连接16 h；然后将连接产物转化到DH5α感受态细菌，用氨苄霉素抗性的琼脂板进行阳性克隆的筛选。挑取阳性克隆，LB培养基中摇菌14 h，然后提取质粒。用XhoI和KpnI限制性内切酶对重组质粒进行双酶切初步鉴定，鉴定正确后再将该质粒送至华大基因公司测序。所构建的质粒命名为pcDNA3-p54nrb-HA。

1.2.4 细胞培养及质粒转染 HepG2细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基。将1×104个HepG2细胞接种于Petri皿中，待细胞生长至融合度达到70%～80%时进行质粒转染，其过程如下：将0.2 μg pcDNA3-p54nrb-HA或pcDNA3-HA阴性对照质粒加入到23 μL OPTI-DMEM培养基，混匀后再加入1 μL Lipofectamine 2000脂质体转染试剂，室温环境中孵育10 min。将150 μL含10% FBS的1640培养液与质粒-脂质体混合物混匀后加入Petri皿中，转染完后将细胞置于5% CO2、37 ℃培养箱中培养。

1.2.5 细胞免疫荧光检测 HepG2细胞转染pcDNA3-p54nrb-HA质粒24 h后进行细胞免疫荧光实验。用PBS洗涤细胞1次；用4 %多聚甲醛固定细胞15 min，用PBS洗涤细胞1次；向细胞加入含有0.1 % Triton X-100的PBS，室温下孵育5 min，用PBS漂洗细胞3次；1‰ 硼氢化钠孵育5 min；用含3 % BSA的PBS室温封闭细胞1 h，然后再用0.1 % Triton X-100/ PBS洗涤细胞1次；加入鼠源性抗HA一抗抗体(稀释比为1:100)，4 ℃孵育过夜，0.1% Triton X-100/PBS 漂洗3次；加入Alexa-Flour 488 标记的羊抗鼠IgG荧光二抗，稀释比为1:1 000)，室温避光孵育1 h，漂洗3 次； DAPI/PBS核染色10 min，洗涤细胞2 次，然后用PBS封片并在荧光显微镜下观察及照相。

2 结果

2.1 pcDNA3-p54nrb-HA载体的构建及鉴定

通过RT-PCR扩增p54nrb基因的蛋白编码区后，对扩增产物进行凝胶电泳，可见在1 400 bp左右处出现清晰条带，与1 461 bp p54nrb目的片段大小相符。对质粒pcDNA3- p54nrb-HA进行双酶及回收酶切产物凝胶电泳后，可见约1.4 kb和5.4 kb大小条带(图1)。pcDNA3-p54nrb-HA质粒测序结果与GenBank所提供的人p54nrb蛋白编码区基因cDNA 序列(GenBank: CR456761.1)一致(图2)，说明该质粒构建成功。

2.2 细胞免疫荧光检测p54nrb在细胞内表达和定位

转染pcDNA3-p54nrb-HA质粒后，静息状态下绿色荧光只分布于细胞核，如图3所示。

3 讨论

图1 p54nrb蛋白编码区的PCR扩增及pcDNA3-p54nrb-HA质粒的酶切鉴定

NONO/p54nrb属于果蝇行为/人类剪接蛋白(drosophila behavior/human splicing,DBHS)家族中的一员。DBHS蛋白几乎参与基因调控的每一个步骤，包括转录调控，RNA加工和运输，以及DNA修复等。现在研究表明，DBHS蛋白是动态蛋白质家族，它介导了广泛的蛋白质-蛋白质和蛋白质-核酸相互作用，总体上可作为一个多用途的分子支架，该家族在细胞生物学中作用复杂而且重要[15]。p54nrb蛋白可以单独或与其他转录因子协同作用，与双链或单链DNA以及单链RNA作用，参与基因转录的激活或抑制，转录的起始、延伸或终止，以及转录后的加工和输出等多个步骤[1]，如p54nrb/NONO与视紫红质增强子区结合，增强视紫红质启动子转录活性，促进视紫红质的表达[16]。p54nrb作为孕激素受体(Progesterone Receptor,PR)转录阻遏物抑制PR介导的孕激素反应元件的反式激活，引起下游RNA的降解可以促进转录的终止[6]。p54nrb基因敲除削弱了ERK激活，进而抑制RNA聚合酶在小鼠胚胎干细胞双线期基因靶点的定位，扰乱了靶基因的激活。NONO/p54nrb参与双链DNA的解螺旋，p54nrb与剪接因子PSF与形成异源二聚体，结合DNA拓扑异构酶I，增强DNA拓扑异构酶I活性。p54nrb还参与超编辑RNA核滞留和DNA损伤修复等。

图2 pcDNA3-p54nrb-HA质粒的测序结果

图3 p54nrb在HepG2细胞的表达与定位(200×)

由于p54nrb参与了基因的复制、转录和转录后mRNA的剪切等多个过程，p54nrb基因突变或异常可引起广泛的基因mRNA谱表达异常，其表达或功能异常与多种生理以及病理疾病有关。有研究表明p54nrb基因可能参与胶原蛋白代谢过程。NONO 作为昼夜节律蛋白PERIOD(PER)的分子伴侣参与衰老和细胞周期的调控。NONO对于局部树突的形态和桥接蛋白的结构有重要作用；p54nrb/NONO可能是一个影响神经发育的重要基因，该基因突变或缺失可能与人智力低下的疾病有关，p54nrb缺陷小鼠有认知和情感缺陷[11]。现研究表明，NONO参与多种肿瘤的发生和发展，如p54nrb与乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、膀胱移行细胞癌、恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌、红白血病等多种肿瘤的发生和发展密切相关[12-14]。p54nrb功能的多样性，促使学者们对其功能进行深入研究，本实验成功地克隆了人p54nrb基因真核表达载体，并通过转染实验证实p54nrb分布于细胞核。该载体的构建，将为后续进一步研究p54nrb功能提供重要工具。