碳量子点的抑菌性能研究

赵 艳

(延安大学 医学院，陕西 延安 716000)

碳量子点(CQDs)是一种新型的荧光材料，具有良好的光学性能、生物相容性和低细胞毒性等优点，受到研究者的广泛关注，成为了医学、生物科学、化学、材料科学等领域的研究热点[1-3]。碳量子点具有碳骨架结构，通常以分散的形式存在，呈球状，碳纳米颗粒平均粒径5 nm。除了具有与半导体量子点相似的优越荧光性能，这种新型碳纳米材料具有反应条件简单、制得容易、绿色环保和生物相容性好等优点，并可通过化学修饰的手段实现功能化，有望在生物和医学检测等领域实现应用。为了绿色合成碳量子点，越来越多的廉价化合物被用作原料，如柠檬酸[4]、抗坏血酸[5]、蛋白质[6]、氨基酸[7]等。杂原子掺杂是一种广泛用作功能化的方法。常见的杂原子有氮、硫、磷、硅等。研究人员对氮掺杂的碳量子点进行了大量研究，发现氮掺杂能够显著增强碳量子点的荧光性能，而且能够有效改善碳量子点的生物相容性。

大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在环境中广泛存在，且对环境变化非常敏感，由于细胞结构和功能组织与绝大多数的微生物都很类似，是一种广泛使用的研究细胞生物学和分子的模型生物。此外，大肠杆菌还被广泛应用于研究重金属[8]、除草剂[9]及纳米材料[10]等外源性物质的毒性。

本文工作采用抗坏血酸和赖氨酸、抗坏血酸和乙二胺2种原料，在水溶液中制备了2种氮掺杂碳量子点，选取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌作为实验菌种，用药敏法进行了抑菌实验，测定了2种氮掺杂碳量子点的抑菌性能，以更直观的现象观察氮掺杂碳量子点的抑菌性能。通过本实验的研究，改变合成材料而改变碳量子点的抑菌性能，降低它对细胞的毒性，使其具有很好的生物兼容性，拓宽了碳量子点在生物分析中的应用，对碳量子点在生物技术和医学细胞技术的应用有一定的参考价值。

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

LS-55荧光分光光度计(美国PE)；UV-2550紫外可见分光光度计(上海岛津国际贸易有限公司)；MM823LA6-NS美的微波炉(广东美的微波电器制造有限公司)；YC-330医用冷藏箱(青岛澳柯玛超低温冷冻设备有限公司)；抑菌剂载体(5 mm直径圆形定性慢速滤纸片，经压力蒸汽灭菌处理后，置120°烤干2 h，保存备用)；DNP-9162型电热恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)；微量移液器(5 mL-50 mL，可调式)；游标卡尺(成都量具刃具总厂)；一次性塑料平板；接种环；玻璃试管。

营养琼脂培养基(pH 7.2～7.4)，北京奥博星生物技术有限责任公司；营养肉汤培养基(pH 7.2～7.4)，北京奥博星生物技术有限责任公司；磷酸盐缓冲溶液(PBS，0.03 mol/L，pH 7.2)；所以试剂均为分析纯，实验用水为超纯水(大于18.2 ΩM·cm)试验菌株为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，均来源于西安交通大学医学院普通微生物菌种保藏管理中心。

1.2 碳量子点的合成

分别合成两种碳量子点(CQDs)：

抗坏血酸和乙二胺为原料合成的CQDsA[11]：称取0.1862 g抗坏血酸，加入50 mL水溶解于烧杯中，磁力搅拌10 min后，加入5.00 mL乙二胺，置于圆底烧瓶中，于363 K下回流3 h，冷却至室温，过滤得到透明的黄色上清液，用水定容至250 mL，其浓度为2.54×10-2mol/L(以碳计)。

抗坏血酸和赖氨酸合成的CQDsB[12]：称取0.1981 g抗坏血酸和0.1658 g赖氨酸于50 mL烧杯中，加入20 mL超纯水充分搅拌溶解后放置微波炉内，550W功率下微波2.0 min，无色透明溶液变成淡黄色透明溶液，表明CQDs逐渐形成。为去除大颗粒物质，以转速1000 r/min离心10 min，用0.22 μm滤膜纯化上清液，透析12 h，取上清液得到CQDs溶液，其浓度为6.75×10-2mol/L(以碳计)。

2 抑菌性实验

2.1 菌悬液的制备

在洁净工作台上，用接种环挑取一定量的供试菌株接入试管斜面培养基上。然后置于37℃的恒温培养箱内培养18～24 h，将供试菌株活化，再用灭菌的生理盐水配制浓度为107～108cfu·mL-1的菌悬液，备用。

2.2 抑菌样片的制备

取定性滤纸，用打孔机打成5 mm直径的圆形小纸片，将滤纸片放入清洁干燥的培养皿中，高压消毒灭菌后，备用。取无菌干燥的直径为5 mm的定性滤纸片，每片滴加量子点溶液20 mL，然后将滤纸片平放于清洁无菌的平板中，开盖置于电热恒温培养箱(37℃)中烘干，备用。

2.3 空白对照样片的制备

取无菌干燥的直径为5 mm的滤纸片，每片滴加无菌纯水20 mL，干燥后备用。

2.4 染菌平板的制备

用接种环蘸取浓度为107～108cfu·mL-1的试验菌悬液，在营养琼脂培养基平板表面上均匀涂抹3次，每次涂抹转动平板60°。盖好平板，置于室温干燥5 min。

2.5 量子点的抑菌活性测定

在无菌洁净工作台上，用无菌镊子取抑菌样片贴放染菌平板表面，每个平板放3片试验样片，1片空白对照，共计4片。贴好以后，用无菌镊子轻压样片，使其紧贴于平板表面。盖好平皿，将平板倒置在37℃的生物培养箱中培养24 h，观察纸片周围有无抑菌圈，并测量抑菌圈的直径，以抑菌圈直径d大小进行判断(d≤7 mm表示无抑菌作用；7 mm

3 结果与讨论

3.1 紫外光谱

将CQDsA用水稀释1000倍后得到2.54×10-5mol/L的CQDs溶液测定其吸收光谱如图1(曲线1)。CQDsA在波长220～350 nm的紫外区有较强的吸收，吸收峰位于262 nm处。

1.CQDsA 2.CQDsB

将CQDsB用水稀释1000倍后得到6.75×10-5mol/L的CQDs溶液测定其吸收光谱如图1(曲线2)。CQDsB在265 nm处有特征吸收峰，这与芳香族碳氢化合物中π键构型、碳碳双键的π-π*跃迁及扩展共轭效应密切相关[14]。2种CQDs的紫外吸收光谱与文献报道方法[15]吻合，CQDs在可见光区域都没有明显吸收，但在紫外区域有显著的吸收。扫描波长越短，吸收强度越大，是CQDs的典型吸收光谱。图谱光滑无杂峰。由于量子点在可见区没有特征吸收峰，故限制了其应用范围。

3.2 荧光光谱图

CQDs是一种在水溶液中可以发出很强荧光的纳米材料。CQDsA是以乙二胺作为氮源制备的碳量子点，不同激发光下的发射光谱如图2所示。从图2可以看出，不同激发波长对CQDs的荧光位置和强度有较大影响。在激发波长为360 nm时，对应的最大发射峰在431 nm处。当激发波长由360 nm增加到395 nm时，发射光谱的位置由431 nm红移到460 nm。随着激发波长不断变化荧光发射峰也在不断变化，荧光强度不断降低，波长发生红移。

λex(1-6):320,340,350,360,370,380 nm

CQDsB是以赖氨酸作为氮源制备的碳量子点。其荧光发射谱图如图3所示。从图3可以看出，在340 nm处，对应的最大发射峰在422 nm处。在激发波长340 nm前，CQDs的荧光强度不断增强且位置发生红移，在激发波长340 nm后，荧光强度不断下降且发射波长位置发生红移现象。

λex(1-6):320,340,350,360,370,380 nm

从图2、图3可以看出，氮掺杂的碳量子点荧光强度大幅度增强，这是由于合成过程中保留了大部分的羧基，为氮掺杂提供大量的活性位点，使得氮掺杂碳量子点的荧光强度大幅增加。碳量子点的荧光发射波长对激发波长有一定的依赖性，这种现象可能是由于CQDs表面的缺陷、粒径尺寸不同、发射空腔和位置不同，导致了多能级的产生，从而使CQDs的发射光谱对激发光具有依赖性[16]。这种现象在CQDs领域普遍存在。

3.3 量子点的抑菌活性测定结果

2种碳量子点的抑菌性能如表1所示。可以看出CQDsA对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都有明显的抑菌作用，CQDsA的浓度为2.54×10-2mol/L时，对金黄色葡萄球菌高度敏感，对大肠杆菌中度敏感；CQDsB的浓度为6.75×10-2mol/L时，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均无抑菌作用。

表1 量子点的抑菌圈大小

注：“-”代表无抑菌圈，“+”代表有抑菌圈

图4A、B分别为CQDsA对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果图，图4C、D分别为CQDsB对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果图。从图4可以看出CQDsA对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有明显的抑菌作用，且对金黄色葡萄球菌的抑菌效果强于大肠杆菌。结合抑菌圈大小，说明CQDsA对金黄色葡萄球菌高度敏感，对大肠杆菌中度敏感。CQDsB对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均无抑菌作用，图中可看出CQDsB对这2种细菌无抑菌圈产生，也从侧面说明CQDsB对细胞无毒性，或者说生物毒性很低。

1，2，3为抑菌样片，4为空白对照样片。

通过以上实验可以看出，CQDsA对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都有抑菌作用，这是因为CQDsA是氮掺杂的碳量子点(N-CQDs)，N-CQDs表面有氨基的存在，氨基与细菌细胞壁结合，破坏细胞壁的完整性，阻止代谢产物以及营养物质正常穿过细胞膜，使细菌失去营养导致生长停滞，最终细胞凋亡[17]。CQDsB是以赖氨酸为原料经微波合成，赖氨酸是一种人体必需氨基酸，是控制人体生长的重要物质抑长素中最重要的成份，对人的中枢神经和周围神经系统都有着重要作用。合成的CQDsB生物毒性低，有很好的生物相容性，故对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌无抑菌作用。

3.4 不同浓度碳量子点对供试菌的抑菌效果

因为CQDsB对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均无抑菌作用，图4实验中CQDs的浓度已高达1000 mg/L，说明CQDsB无细胞毒性，故不再进行研究。以下主要探讨CQDsA对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果。探讨了浓度分别为6 mg/L、12 mg/L、24 mg/L、48 mg/L、240 mg/L、480 mg/L的CQDsA溶液对供试菌的抑菌效果，结果见表2。从表中可以看出当CQDsA浓度达到480 mg/L时，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都有明显的抑菌作用，当CQDsA浓度为48 mg/L时，量子点对大肠杆菌无抑菌作用，当CQDsA浓度为24 mg/L时，量子点对两种细菌均无抑菌作用，说明CQDsA对金黄色葡萄球菌的抑菌作用强于大肠杆菌，这可能与细菌细胞壁的结构有关。金黄色葡萄球菌属于革兰氏阳性菌，细胞壁含大量的肽聚糖和磷壁酸，磷壁酸所带的负电荷能与碳量子点上游离的氨基结合，从而干扰细胞膜上部分高活性合成酶的合成，影响细胞正常代谢活动，抑制细菌生长，达到抑菌作用。大肠杆菌属于革兰氏阴性菌，细胞壁最外层是一层较厚的类脂多糖物质，它能吸附质子化的碳量子点形成聚合物，破坏类脂多糖的结构，扰乱细菌新陈代谢，导致细菌死亡。由于合成过程中质子化的碳量子点较少，对细胞壁破坏能力弱，故抑菌作用较弱。

表2 不同浓度碳量子点溶液的抑菌试验结果(n=3)

4 结论

本文采用2种方法合成了具有高荧光强度的CQDs，通过对2种革兰氏细菌的抑菌试验，初步鉴定了CQDs的抑菌性能。CQDsA用乙二胺作钝化剂进行表面改性，N原子和C原子半径相近，作为电子供体对CQDs进行修饰，得到的氮修饰的CQDs表现出更优异的光学性能。这些氮原子改变了CQDs的电子分布，故改变了CQDs的性质。此CQDs对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都有很强的抑制作用，对金黄色葡萄球菌的抑菌效果强于大肠杆菌。CQDsB对2种细菌都无抑菌作用。选择不同合成材料，可以有效的降低碳量子点的生物毒性，使其更好地应用于细胞成像、生物医学开发和利用。