肝纤维化中TGF-β/Smad信号通路研究进展

于 洋，史嘉翊，黄 珍，刘增瑞，吴 丹

(牡丹江医学院医药研究中心，黑龙江 牡丹江 157011)

肝星状细胞(hepaticstellate cell, HSC)的活化是肝纤维化的关键环节[1]。转化生长因子β(transforming growth factor beta, TGF-β)是主要的致纤维化因子[2]，该细胞因子可以上调HSC合成细胞外基质(extracellu-larmatrix, ECM)，是加速肝纤维化发生的主要因素。TGF-β的主要功能是维持免疫耐受和参与调控炎症反应[3]，在肝纤维化发生时表达水平显著增高。肝纤维化的过程是由多条细胞信号传导通路控制的结果，其中TGF-β/Smad信号传导通路是激活HSC促进ECM生成的主要途径。因此，以TGF-β为靶点，阻断或调控该信号的传导可为肝纤维化的防治研究提供新策略。

1 肝纤维化的发病机制

肝纤维化是肝脏内弥漫性ECM异常增生[4]，我国该病的主要病因为病毒性肝炎，大量饮酒及长期服用药物也可诱发肝损伤，激活肝Kupffer细胞、血小板等分泌各种细胞因子，其中包括TGF-β、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)等，多种细胞因子共同作用介导HSC转化为肝成纤维细胞(myofibroblasts, MFB)，合成大量ECM，并逐渐沉积从而引起肝纤维化[5]。

2 TGF-β/Smad通路参与分子

2.1 TGF-β超家族TGF-β超家族由TGF-β、激活素(activin)、生长分化因子(growth differentiation factor, GDF)、骨形态发生蛋白(bone morphogenicprotein, BMP)等数十个成员组成，该家族成员在细胞增殖、凋亡、纤维化发生发展过程中起着关键作用[6]。TGF-β是由位于N-末端的潜态相关肽(latency associated peptide, LAP)和C-末端成熟结构域组成的大前体分子组成[7]。在这种前体中，LAP起着多功能肽的作用，能够调节TGF-β1在整个发展过程中和维持成人组织稳态中发挥关键作用。最初，LAP的N末端附近的疏水残基与成熟的TGF-β结合，LAP与成熟生长因子经Furin蛋白酶处理后非共价结合形成小潜在复合体(small latent complex,SLC)。在分泌过程中，LAP也与潜伏的TGF-β结合蛋白(latent TGF-β binding protein, LTBP)共价相互作用形成大的潜伏复合物(large latent complex, LLC)，并且以这种形式从细胞中分泌TGF-β，这个过程为TGF-β的活化[8]。在LTBPs不存在的情况下，LAP内的反应性半胱氨酸(Cys)与成熟TGF-β中的游离半胱氨酸形成不正确配对的二硫键，从而确保SLC以非活性形式分泌。TGF-β信号传导依赖于从LLC中释放成熟的配体，这一过程通过激活剂如血小板反应蛋白-1(thrombospondin-1, TSP-1)等来介导[9]。

2.2 TGF-β超家族受体TGF-β由靶细胞膜特异性受体(TβR)介导，这些受体有一个富含半胱氨酸的胞外域，一个跨膜域和一个富含丝氨酸(Ser)/苏氨酸(Thr)的胞内域。TβR存在着Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三种形式，其中TβRⅠ、TβRⅡ型为信号传递受体，其跨膜区具有Ser/Thr蛋白激酶活性，在没有配体的情况下，它们保持二聚体的形式，与细胞信号传导有关[10]。TGF-β配体与TβRⅡ在胞外端结合，TβRⅡ活化并激活TβRⅠ的GS区丝氨酸残基，TβRⅠ磷酸化，并与配体形成异源三聚体复合物，从而使生物信号从细胞内传导。TβRIII又称为Endoglin，CD105，本身缺乏蛋白激酶活性，为细胞膜糖蛋白，主要功能是调节受体与配体之间的相互作用，以及调节TβRⅡ在细胞膜的表达[11]，在TGF-β发挥生物学功能中起着主要作用。

2.3 Smads蛋白家族Smad蛋白位于TGF-β的下游，该蛋白作为中介将配体受体结合的信号转至细胞核中，调节靶基因的转录。Smad蛋白有保守的MHl和MH2区及连接两者的连接区(linker)。Smad蛋白未激活时，MH1和MH2相互抑制，活化后MH2丝氨酸基序(SSXS)被磷酸化，可以解除二者之间的相互抑制[12]。Smad蛋白家族由9个成员组成，被分为3类。第一类是由Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8、Smad9组成的受体调节型Smads(R-Smad)，可与活化的TβRⅠ直接作用并被磷酸化激活。NLS可使Smad蛋白向细胞核转移，SSXS磷酸化后活化Smad蛋白。第二类是共同调节型Smads(Co-Smad)，包括Smad4，不能和TβR结合，也不能被磷酸化，但能使Smad复合物保持有效的转录活性。第三类为抑制性Smad(I-Smad)，包括Smad6和Smad7，与R-Smad结构相似，竞争性结合TβR-I，阻止R-Smad的磷酸化[13]。

3 肝纤维化发生发展中的TGF-β/Smad通路

在TGF-β/Smad通路中，活化的TGF-β连续激活TβRⅠ、TβRⅡ，TβRⅠ使R-Smad磷酸化，构型发生变化后与Co-Smad结合，进入细胞核，与DNA结合，参与基因调控。同时，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)表达降低，基质金属蛋白酶抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs)表达升高，使ECM合成增加而分解减少。肝脏可以产生纤溶酶原经激活后变为纤溶酶，进一步激活MMPs，降解ECM。而TIMPs能特异性抑制MMPs的活性[6]。

3.1 Smad2/3磷酸化Smad2和Smad3是触发TGF-β信号通路中的关键介质所在，HSC上Smad2的缺失，可通过增加磷酸化、核转运等促进Smad3相关的肝纤维化的进展。Zhang L[14]等人在实验中证实，Smad2的过表达减弱了ColI和TIMP-1的产生，但增强了MMP-2的表达，而Smad3的过表达显示相反的效果，最终导致ECM沉积。Smad2激活靶基因转录的前提是需要结合核DNA连接蛋白FAST-1。而Smad3可与DNA上的Smad结合元件(Smad-binding element, SBE)直接结合[15]。PPM1A蛋白是一种常见的Smad磷酸酶，具有镁离子或锰离子依赖性，能在细胞核内与磷酸化后的Smad2/3结合，从而终止TGF-β信号转导[16]。

3.2 对Smad7的研究Smad7是一种抑制性Smad蛋白，在多个途径上抑制TGF-β信号通路。TGF-β刺激细胞后，mRNA和蛋白水平上调，Smad7蛋白竞争性结合TGF-I型受体MH2结构域的L3环阻断R-Smad磷酸化并最终终止TGF-β信号传导，Smad7还可以招募E3连接酶Smurf1/2或Nedd4-2到靶向活化的TGF-β受体，导致受体的泛素化降解[17]。

3.3 TGF-β/Smad通路与ADAMTS-2研究表明：凝血酶敏感蛋白-1(thrombospondin-1, TSP-1)能够介导TGF-β1的激活[18]，解整合素样金属蛋白酶-2(A Disintegrin and Metalloprotease with Thrombospondin Motif 2, ADAMTS-2)可通过TSP-1与间隔序列同ECM相黏附。ADAMTS-2能切割Ⅰ-Ⅲ型前胶原蛋白氨基端，将前胶原蛋白转变为成熟胶原。TGF-β通过TGF-β/Smad通路上调ADAMTS-2的mRNA表达水平，从而促进ADAMTS-2蛋白的释放[19]。实验研究显示与静息的HSC相比，活化的HSC使ADAM-8,-9,-12,-28的mRNA表达增加[20]。敲除ADAMTS-2基因小鼠可有效对抗四氯化碳引起的肝纤维化[21]，因此ADAMTS-2及TGF-β可能存在协同致肝纤维化作用。

3.4 BMP7/Smad与TGF-β/SmadBMP7也属于TGF-β超家族，TGF-β和BMP-7均为Smad信号通路的下游信号，二者相互调节，以平衡其生物活动。BMP-7具有抗纤维化和抗炎作用，BMP-7结合BMP受体激活R-Smad1/5/8。磷酸化的R-Smads与Smad4形成异聚复合物，转移到细胞核中，诱导其靶基因的转录，还可以对miR-200和miR-29进行调控，对纤维化有抑制作用[22]。

3.5 CTGF与TGF-β/Smad结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)是一种富含半胱氨酸的多肽，其具有促细胞增殖、迁移及分化作用，介导TGF-β的促细胞增殖及ECM的合成，与肝纤维化的形成有着密切关系。CTGF是TGF-β的下游反应元件，TGF-β可以通过多种途径诱导CTGF的生成[23]。Holmes等[24]将各种CTGF/SMAD表达载体转染进成纤维细胞，观察到转染含Smad3和Smad4表达载体的细胞中CTGF表达显著升高。研究显示，CTGF siRNA对HSC的I、III型胶原的mRNA表达有明显抑制作用[25]。

4 展望

研究表明，肝纤维化的发生发展是可逆的，对其进行逆转或阻断是当前肝脏疾病治疗的重点[26]。在一定的条件下，可以通过抑制HSC的活化或促进HSC的凋亡、增强胶原降解等逆转该过程。肝纤维化发生发展过程由多条信号通路共同参与，其中TGF-β/Smad信号传导通路已经成为治疗肝纤维化的关键靶点。当前针对该通路治疗肝纤维化的途径主要有以下几种：(1)减少TGF-β的表达与活化，可利用TGF-β抗体或TGF-β反义mRNA来阻止HSC分泌TGF-β；(2)作用于TGF-β受体的治疗，阻断TGF-β与受体结合[27]。HONG-CHUANG等[28]通过构建不含胞内激酶区外源性TβRⅡ，与内源性TβRⅡ竞争结合配体，作用于CCl4诱导的肝纤维化大鼠模型。外源性的受体由于缺少胞内激酶区，不能磷酸化，信号转导不能下传，从而阻断其与TGF-β的结合，结果显示TGF-βR-Ⅱ蛋白明显阻止了大鼠肝纤维化的进展，为肝纤维化及其他纤维化疾病的治疗提供了可能；(3)针对TGF-β下游受体激酶信号传导的治疗。Dooley等[29]发现，通过抑制Smad2/3磷酸化，活化的Smad复合物的核移位和(CAGA)9-MLP-Luc的激活，阻断TGF-β/Smad信号传导，理论上下调Smad2/3或上调Smad7均为可行的基因治疗策略。CTGF是在TGF-β作用下HSC合成ColI的下游介导者，CTGF对HSC周期进程无影响，作用比较单一，主要介导TGF-β的促纤维化作用，并且只局限于结缔组织，靶向CTGF抗纤维化的治疗可能更有效[30]。

综上所述， TGF-β/Smad信号通路在肝纤维化的发生发展中起着尤为关键的作用。以该通路为靶点，阻断通路中的某一环节进而阻断或逆转肝纤维化，是当前国内外肝纤维化治疗的研究重点。随着研究人员对肝纤维化机制的不断深入研究，相信有更多的抗肝纤维化靶点被发现，为肝纤维化治疗提供新的思路。